脂肪干细胞覆膜聚丙烯补片减轻疝修补术后炎症反应的研究

张方捷 高国栋 叶静 黄永刚 吴浩 王平

·论著·

脂肪干细胞覆膜聚丙烯补片减轻疝修补术后炎症反应的研究

张方捷 高国栋 叶静 黄永刚 吴浩 王平

目的探讨脂肪干细胞（ADSCs）覆膜聚丙烯补片对大鼠疝修补术后炎症反应的影响。方法培养扩增检测脂肪干细胞并接种到聚丙烯补片上，体外培养10天。成年SD大鼠12只，分为覆膜组6只，未覆膜组6只，分别将ADSCs覆膜聚丙烯补片和聚丙烯补片植入覆膜组和未覆膜组大鼠的腹壁肌肉表面，检测大鼠术前及术后3、7、14、21、28天血常规、肿瘤坏死因子-琢（TNF-琢）、白细胞介素-1茁（IL-1茁）水平。结果ADSCs在聚丙烯补片上附着生长良好，免疫荧光检测显示干细胞特异性标记CD90表达逸97%。覆膜组在术后14天炎症反应高峰时期白细胞计数［（10.86±0.56）伊109/L比（11.92±0.56）伊109/L，P<0.05］、TNF-琢［（87.12±12.59）滋g/L比（175.28±34.37）滋g/L，P< 0.01］、IL-1茁［（275.69±54.28）滋g/L比（501.36±98.15）滋g/L，P<0.01］均低于未覆膜组，差异有统计学意义。结论与聚丙烯补片组比较，ADSCs覆膜聚丙烯补片可减轻大鼠疝修补术后全身炎症反应。

大鼠；疝修补术；炎症反应；脂肪源干细胞；聚丙烯；补片

用人工合成补片进行疝修补手术是治疗各种腹部疝疾病广泛使用的方法，使术后疝复发率大大降低。而人工合成补片，尤其是应用最广泛的聚丙烯补片在使用中仍存在诸如慢性疼痛、局部异物感、腹壁顺应性下降等问题，对外科医师和患者造成困扰。产生这些问题的一个重要原因是人工合成材料补片使用后宿主组织的（亚）急性炎症反应导致局部纤维组织明显增生，造成神经血管压迫，产生异物感，引起慢性疼痛，并使腹壁顺应性下降。我们设想使用脂肪干细胞（adipose-derived sterm cells，ADSCs）覆盖聚丙烯补片，避免补片与机体的直接接触，使植入体内的ADSCs在局部微环境作用下向机体需要的方向分化，以减轻补片植入体内后的炎症反应和组织纤维化，从而减轻异物感、慢性疼痛，提高腹壁顺应性，改善患者术后的生活质量。

1 材料与方法

1.1 材料F1代SD脂肪源干细胞（CELLBIO货号CBR-130478）购自上海赛齐生物。SPF级SD大鼠，购自浙江省实验动物中心，6月龄，雄性，体质量，230～250g，合格证书编号0017686，许可证号SCYK（浙）2014-0001。聚丙烯补片购自BARD公司。实验过程中动物处置符合国家科学技术委员会发布的关于善待实验动物的指导性意见规定。

1.2 方法

1.2.1 脂肪干细胞的培养和鉴定脂肪干细胞解冻后置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，接种于25mL培养瓶中，置于37益、0.05%的C02孵箱中，每3天换液1次。待细胞形态已恢复并贴满瓶壁，即行传代。将培养瓶里的培养基倒去，加3～5mL Hanks'液洗涤后弃去。加0.5～1mL 0.25%含EDTA的胰酶消化，消化时间1～3min。轻轻晃动瓶壁，细胞脱落下来后加入3～5mL培养基终止消化。用移液管轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之完全脱落，然后将溶液吸入离心管内离心1000rpm/5min。弃上清，1:2传代。

脂肪干细胞主要从三个方面进行鉴定评估：细胞的形态：显微镜观察细胞形态；细胞表面CD90的抗原表达：采用细胞免疫荧光染色法，细胞爬片6 h，4%多聚甲醛固定30min，3%Triton IOOX通透20 min，山羊血清封闭30min，按说明书加入相应比例稀释的一抗，孵育4益过夜，加入荧光二抗（Alexa Fluor 555）37益孵育1h，DAPI核染10min，荧光显微镜下观察。台盼蓝染色法鉴定细胞活力：取细胞悬液，滴加等量0.4%台盼蓝染液，混匀后吸取部分加入细胞计数板中进行计数。

1.2.2 脂肪干细胞覆膜聚丙烯补片制备将聚丙烯补片剪成5mm伊5mm大小，浸泡75%乙醇中24h，以D-hank's液反复清洗去除乙醇。将培养至第2代的脂肪干细胞消化、重悬后计数为5伊108/L。每块补片接种100滋L细胞悬液，分别放置于6孔培养板中。4h后加入DMEM-F12培养液8mL，于37益、5%的CO2培养箱中培养，每3天更换培养液1次，共培养10天。

1.2.3 动物分组、手术及血样采集成年雄性SD大鼠12只，体质量（250±20）g，随机分为覆膜补片组（覆膜组）和未覆膜补片组（未覆膜组），每组6只。手术前一天尾静脉抽取血样检查血常规、肿瘤坏死因子-琢（TNF-琢）、白细胞介素-1茁（IL-1茁）。10%水合氯醛0.3mL/100g麻醉，5万U/只青霉素钠肌肉注射预防感染，切开大鼠腹侧壁约1cm，分别将覆膜补片及未覆膜补片植入腹壁肌层下方，补片缝合固定，可吸收线缝合切口。术后3、7、14、21、28天抽血检验血常规、TNF-琢、IL-1茁。

1.3 统计学方法应用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂肪干细胞培养及鉴定ADSCs接种于培养皿24h后细胞形态开始恢复为梭形及多边形，传代后细胞呈长梭形，并形成小集落，呈束状、菊花状或旋涡状排列，生长有方向性。免疫荧光检测结果显示，干细胞特异性标记CD90表达逸97%。台盼蓝染色显示细胞存活良好。

2.2 覆膜聚丙烯补片制备共培养后可见脂肪干细胞附着于聚丙烯补片上生长，编织密集处生长较密集。

2.3 大体观察聚丙烯补片植入后实验动物无死亡，未出现侵蚀穿透等表现，伤口愈合均良好。

2.4 两组大鼠手术前后白细胞数值比较覆膜组和未覆膜组术后均出现白细胞升高，14天时达到最高峰，两组差异有统计学意义（P<0.05），之后数值下降。见表1。

2.5 两组大鼠手术前后血清TNF-琢和IL-1茁比较术前两组血清TNF-琢和IL-1茁差异无统计学意义（P>0.05）；术后3、7、14、21天，两组大鼠血清TNF-琢和IL-1茁水平均明显上升，14天时达到峰值，差异均有统计学意义（P均<0.01）；术后28天，未覆膜组两项指标仍高于覆膜组，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表2～3。

3 讨论

腹股沟疝是普外科常见病、多发病，区域性调查显示我国腹股沟疝的发病率为3译～5译[1]。腹壁切口疝是腹部手术后常见的并发症，发生率3%～20%[2]。对于腹股沟疝和腹壁切口疝手术在人工合成材料补片出现以前，主要通过单纯缝合修补来实现，其复发率高。目前多应用人工合成材料补片进行修补，从而使术后复发率大大降低[3]。但人工合成材料补片使用中，尤其是使用最为广泛的聚丙烯补片使用中存在慢性疼痛、局部异物感明显、腹壁顺应性下降等问题使治疗效果并不十分令人满意，人工合成材料补片使用后宿主组织的(亚)急性炎症反应是导致上述问题的重要原因[4]。

表1 两组大鼠手术前后白细胞数值比较（，伊109/L）

表1 两组大鼠手术前后白细胞数值比较（，伊109/L）

注：与未覆膜组比较，*P<0.05

组别覆膜组未覆膜组鼠数（只）6 6术前7.01±1.22 7.21±1.19 3d 8.35±0.56 9.66±1.70 7d 10.59±0.36 10.87±0.79 14d 10.86±0.56* 11.92±0.56 21d 9.32±0.63 9.55±0.71 28d 8.20±0.54 8.51±0.55

表2 两组大鼠手术前后血清TNF-琢水平比较（，滋g/L）

表2 两组大鼠手术前后血清TNF-琢水平比较（，滋g/L）

注：与未覆膜组比较，*P<0.01

组别覆膜组未覆膜组鼠数（只）6 6术前5.23±2.56 5.17±2.87 3d 41.87±8.54 64.21±9.57 7d 50.12±7.85 90.78±75.54 14d 87.12±12.59* 175.28±34.37 21d 51.27±13.51* 91.56±20.41 28d 12.47±5.45 14.49±11.42

表3 两组大鼠手术前后血清IL-1茁水平比较（，滋g/L）

表3 两组大鼠手术前后血清IL-1茁水平比较（，滋g/L）

注：与未覆膜组比较，*P<0.01

组别覆膜组未覆膜组鼠数（只）6 6术前9.54±3.57 9.21±2.49 3d 78.29±15.24 159.28±54.38 7d 198.17±24.48 334.35±89.45 14d 275.69±54.28* 501.36±98.15 21d 182.35±49.82* 324.26±33.75 28d 40.73±21.25 51.46±24.25

脂肪组织位于可以较易获得的结缔组织中，与骨髓一样来源于间充质。Zuk等[5]于2001年首先发现脂肪干细胞（ADSCs）在适当的诱导条件下能向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及神经组织定向分化。2009年美国斯坦福大学医学院的研究人员发现抽出的人体脂肪是培养干细胞的最佳“温室”。在脂肪干细胞内，有两种转录因子的表达水平高于皮肤成纤维细胞，表明在初始状态下，脂肪干细胞更容易被诱导为诱导多能干细胞，并且利用脂肪干细胞培养诱导多能干细胞不需要饲养细胞，这无疑提高了其安全性[6]。脂肪干细胞还可以分泌血管内皮细胞生长因子，促进血管生成[7]。脂肪干细胞来源充分，可以反复取材，无免疫排斥，不涉及医学伦理学问题，细胞增殖快速，取材简便，分离容易，避免抽取骨髓，损伤较小，患者易于接受。Altman等[8]发现，植入体内ADSCs在局部微环境作用下可以同时向成纤维细胞、鳞状上皮细胞及血管内皮细胞方向分化。另一方面，ADSCs具有旁分泌的功能，可以分泌多种胶原、纤维连接蛋白及生长因子，能间接促进组织的愈合[9]。本实验结果表明，ADSCs提取培养简单方便，细胞活力好，细胞CD90表达高达97%以上，ADSCs也可在聚丙烯材料补片上良好生长。

聚丙烯等人工合成材料植入体内后引发的炎症反应可以引起局部组织肿胀坏死，并导致明显的纤维化，使网片皱缩变形，局部组织硬度增加，顺应性下降[10]，使患者出现疼痛、异物感，并容易出现复发及感染等。本研究中覆膜组和未覆膜组术前白细胞、TNF-琢和IL-1茁均无显著性差异，在术后3、7、14、21、28天时未覆膜组三项指标均高于覆膜组，其中14天时两组白细胞数值有显著差异，3、7、14、21天时血清TNF-琢和IL-1茁水平显著性差异与表不符。综合各项指标，相较聚丙烯补片，植入ADSCs覆膜聚丙烯补片大鼠疝修补术后全身炎症反应可减轻，达到更好的治疗效果。

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（收稿：2016-10-08修回：2016-10-27）

Effect of Adipose-derived Stem Cells Coated Polypropylene Patch on the Inflammation after Herniorrhaphy

ZHANG Fangjie,GAO Guodong,YE Jing,HUANG Yonggang,WU Hao,WANG Ping.Department of Hernia& Abdominal Wall Surgery,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou(310000),China

Objective To investigate the effect of adipose-derived stem cells（ADSCs）coated polypropylene patch（PP）on relieving the inflammation after herniorrhaphy.M ethods The ADSCs were seeded into polypropylene mesh and in vitro cultured for 10 d.Twelve SD rats were random ly divided into control group and experimental group, with 6 rats in each group.PP coated with ADSCs and PP were implanted into the abdominal wall muscles of ex原perimental group and control group,respectively.The blood samples were collected before and 3,7,14,21 and 28d after operation to measure white blood cell（WBC）count,TNF-琢and IL-1茁.Results ADSCs grew well on the polypropylene patch,and the CD90 expression was more than 97%by immunofluorescence.In the peak period of in原flammatory reaction on Day 14,the WBC count[（10.86±0.56）伊109/L vs（11.92±0.56）伊109/L,P<0.05],TNF-琢（87.12±12.59滋g/L vs 175.28±34.37滋g/L,P<0.01）,IL-1茁（275.69±54.28滋g/L vs 501.36±98.15滋g/L,P<0.01）in experimental group were lower than those of control group.Conclusion Polypropylene patch coated with ADSCs can effecti-vely reduce the systemic inflammatory response after herniorrhephy in rats.

rats;herniorrhaphy;inflammatory response;adipose-derived stem cells;polypropylene;patch

杭州市医疗卫生及重点专科专病科研攻关专项基金项目资助（No.20130633B03）

杭州市第一人民医院疝和腹壁外科（杭州310000）

高国栋，E-mail：flyht66@sina.com