血根碱对宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力影响机制研究

李贞彩，姜 平，王秋宇，杨 丽，符鹏晓，张金茹

(河南省南阳市中心医院妇科 473003)

论著·基础研究

血根碱对宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力影响机制研究

李贞彩，姜 平，王秋宇，杨 丽，符鹏晓，张金茹

(河南省南阳市中心医院妇科 473003)

目的 探讨血根碱对宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的影响机制。方法 分别用MTT法、流式细胞仪、细胞划痕实验、 Transwell小室检测血根碱作用后的宫颈癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭能力。Western blot检测经血根碱作用后宫颈癌细胞中E-Cadherin、PTEN、β-catenin、MMP2的蛋白表达水平。结果 0.6、0.8 μmol/L血根碱对宫颈癌细胞增殖具有抑制作用。0.8 μmol/L血根碱作用48 h后宫颈癌细胞HeLa和Siha凋亡率高达(45.68±2.26)%和(31.89±3.80)%。0.8 μmol/L血根碱作用3 h后宫颈癌细胞HeLa和Siha黏附率仅有(67.45±2.13)%和(73.59±2.61)%。0.8 μmol/L血根碱作用16 h后宫颈癌细胞HeLa和Siha侵袭数目仅有(39.64±1.98)个和(43.87±2.83)个。经血根碱作用后的宫颈癌细胞中E-Cadherin和PTEN的表达量增加，β-catenin和MMP2的表达量减弱。结论 血根碱对宫颈癌细胞具有抑制增殖及促凋亡作用，其机制可能与黏附蛋白E-Cadherin、β-catenin和PTEN、MMP2有关。

宫颈肿瘤;血根碱;侵袭;迁移;增殖

宫颈癌是一种常见的女性恶性肿瘤。据统计，每年宫颈癌的发病率在女性恶性肿瘤中仅次于乳腺癌[1]。宫颈癌发病率高，世界范围内有85%的宫颈癌患者来自于发展中国家。在我国每年有13万的新增宫颈癌患者，占世界宫颈癌发病率的25%以上。20岁以下女性很少患病，40～50岁是宫颈癌的高发年龄段[2]。宫颈癌传统的治疗方法有手术治疗和放疗。这些治疗方法疗效有限，而且不良反应大。寻找新的安全有效的治疗方法是目前研究的热点。血根碱(sanguinarine)是罂粟科植物博落回的提取物。血根碱具有多种药理活性，具有抗菌、消炎、杀虫、抗病毒、抗氧化、抗真菌等多种药理作用，可以改善肝功能，提高免疫力。近年来研究发现，血根碱具有抗肿瘤的作用[3]。血根碱对胰腺癌、肝癌都具有治疗效果。血根碱对宫颈癌的作用机制尚少见相关报道。本研究以宫颈癌细胞HeLa和Siha为研究对象，探讨血根碱对宫颈癌细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的影响机制，以期为治疗宫颈癌提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料 宫颈癌细胞HeLa和Siha均由本科实验室保存;兔抗E-Cadherin多克隆抗体、兔抗β-catenin多克隆抗体、兔抗PTEN多克隆抗体、兔抗基质金属蛋白酶2(MMP2)多克隆抗体、鼠抗人β-actin抗体购自美国Cell Signaling。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞培养用含10%FBS，100 U/mL青霉素，0.1 mg/mL链霉素，2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM细胞生长液。培养条件为37 ℃，5%CO2培养箱。细胞传代用0.25%的胰蛋白酶。

1.2.2 MTT检测细胞增殖情况 宫颈癌细胞HeLa和Siha经血根碱终浓度为0.6、0.8 μmol/L的含药培养基作用0、6、12、24、48、72 h。MTT法检测细胞增殖情况，计算细胞抑制率[4]。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 宫颈癌细胞HeLa和Siha经0(对照组)、0.8 μmol/L(药物作用组)的血根碱作用48 h后，取1 mL细胞悬液，收集细胞后，加入5 μL PI和5 μL Annexin-V，避光反应10 min，用流式细胞仪检测细胞的凋亡[5]。

1.2.4 血根碱对宫颈癌细胞黏附力影响 宫颈癌细胞HeLa和Siha经0、0.6、0.8μmol/L的血根碱作用于宫颈癌细胞，经0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，观察细胞贴壁情况，显微镜下计数每个时间点的细胞贴壁数量，计算细胞黏附率[6]。

1.2.5 血根碱对宫颈癌细胞迁徙能力影响 移液枪枪头在宫颈癌细胞单层细胞上轻轻划出一道细痕，经0.6、0.8 μmol/L的血根碱作用24、48 h后，观察细胞划痕宽度，分析细胞迁徙能力[7]。

1.2.6 血根碱对宫颈癌细胞迁移能力影响 0、0.6、0.8 μmol/L的血根碱作用宫颈癌细胞，Transwell 小室检测细胞48 h迁移能力[8]。收集各组中下室的细胞，在显微镜下计数，计算细胞迁移数。

1.2.7 血根碱对宫颈癌细胞侵袭力影响 用培养基DMEM稀释Matrigel配置成基质胶，在24孔的Transwell小室中加入基质胶。宫颈癌细胞HeLa和Siha经0.6、0.8 μmol/L的血根碱作用后16 h，Transwell检测细胞侵袭能力，显微镜下观察细胞侵袭细胞数量。

1.2.8 Western blot检测相关蛋白表达 取经0、0.6、0.8 μmol/L药物作用48 h后的宫颈癌细胞HeLa和Siha，按照常规方法[9]提取细胞总蛋白。蛋白浓度测定按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书操作。提取蛋白变性后，SDS-PAGE凝胶电泳后，4 ℃转膜90 min。经5%脱脂奶粉封闭后，依次与一抗(500倍稀释)和二抗(1 000倍稀释)孵育反应后，在暗室中显影定影。

2 结 果

2.1 MTT检测细胞增殖情况 血根碱对宫颈癌细胞HeLa和Siha增殖有明显的抑制作用，抑制作用随着作用时间的增加而增加，见图1。

图1 MTT检测血根碱对宫颈癌细胞HeLa和Siha抑制情况

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡结果 0.8 μmol/L的血根碱作用后的HeLa细胞凋亡率与对照组相比显著升高(P<0.01)，0.8 μmol/L的血根碱作用后的Siha细胞凋亡率与对照组相比显著升高(P<0.01)，见图2。

2.3 血根碱对宫颈癌细胞黏附率影响 宫颈癌细胞HeLa和Siha经血根碱作用后细胞黏附率与血根碱(0 μmol/L)相比有所降低。宫颈癌细胞的黏附率随着血根碱药物作用浓度的增加而降低，随着药物作用时间的延长而减弱，见表1、2。

A：血根碱作用后的HeLa细胞凋亡情况；B：血根碱作用后的Siha细胞凋亡情况；C：HeLa细胞凋亡率；C：Siha细胞凋亡率；a：P<0.01，与对照组比较

图2 血根碱作用后的宫颈癌细胞凋亡情况表1 宫颈癌HeLa细胞经血根碱作用后的黏附率

a：P<0.05，b:P<0.01，与0 μmol/L比较

表2 宫颈癌Siha细胞经血根碱作用后的黏附率±s，%)

a：P<0.05，b:P<0.01，与0 μmol/L比较

2.4 血根碱对宫颈癌细胞迁徙能力影响 0.6、0.8 μmol/L的血根碱作用24、48 h后细胞划痕与0 μmol/L血根碱相比差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。

a：P<0.01，与0 μmol/L比较

图3 血根碱对细胞迁徙能力影响

2.5 血根碱对宫颈癌细胞迁移能力影响 0.6 μmol/L和0.8 μmol/L的血根碱作用后的宫颈癌细胞与0 μmol/L血根碱相比迁移数明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

a：P<0.05；b:P<0.01，与0 μmol/L比较

图4 血根碱对宫颈癌细胞迁移能力影响

2.6 血根碱对宫颈癌细胞侵袭力影响 血根碱作用后宫颈癌细胞的侵袭能力减弱。随着血根碱作用浓度的增加，侵袭力减弱越明显，见图5。

a：P<0.01，与0 μmol/L比较

图5 血根碱对宫颈癌细胞侵袭力影响

2.7 Western blot检测细胞中相关蛋白表达 经血根碱作用后的宫颈癌细胞中E-Cadherin和PTEN的表达量与0 μmol/L相比明显增加，随着药物浓度的增加表达量也增加。经血根碱作用后的宫颈癌细胞中β-catenin和MMP2的表达量与0 μmol/L相比明显减弱，随着药物浓度的增加表达量也减弱,见图6。

1：0 μmol/L；2：0.6 μmol/L；3：0.8 μmol/L

图6 Western blot检测血根碱作用后宫颈癌细胞中相关蛋白表达水平

3 讨 论

宫颈癌发病率在发展中国家高于发达国家，农村高于城市。目前宫颈癌的治疗方法主要有手术治疗、放疗等。随着治疗方法的不断改进，宫颈癌的治疗也越来越规范，但这些治疗方法仍然存在很大的局限性。癌细胞的迁徙和侵袭是宫颈癌治疗失败和复发的重要原因[10]。研究宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力对于治疗宫颈癌具有重要意义。血根碱具有消炎、抗菌、增强免疫力等多种作用，在细胞凋亡和增殖中具有重要作用。近年来研究发现，血根碱对胰腺癌、肝癌都具有很好的治疗效果，对癌细胞的增殖、凋亡、转移、侵袭都具有一定作用[11]。本研究中MTT检测血根碱药物作用后的宫颈癌细胞增殖能力明显降低，且随着药物作用时间的增加而增加。流式细胞仪检测结果表明，血根碱可以显著促进宫颈癌细胞的凋亡。

肿瘤细胞的侵袭和转移是肿瘤发生和发展中关键的阶段。肿瘤细胞从发病部位扩散到远处的正常器官需要癌细胞黏附于正常组织，穿过血管内皮下基底膜进入血液中，随着血液扩散到周围组织中，黏附于靶器官内皮细胞中，在靶器官中克隆生长，促进转移灶的发生。细胞黏附有两种，一种是细胞与细胞之间的黏附，另一种是细胞与基质之间的黏附[12]。黏附蛋白(E-cadherin)在细胞间的黏附中起重要作用，是一种钙依赖型的跨膜糖蛋白。有研究表明，E-cadherin在结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌中表达下调，E-cadherin表达量越高，癌症的预后越好[13]。本研究通过检测宫颈癌细胞经血根碱作用后的细胞黏附力证明，血根碱可以抑制宫颈癌细胞的黏附力。Western blot检测结果表明，药物作用后的宫颈癌细胞中E-cadherin的表达量明显上升，说明血根碱抑制宫颈癌细胞黏附力作用机制与E-cadherin蛋白有关。

E-cadherin在细胞侵袭和转移过程中与Catenins有密切关系，E-cadherin传递细胞信号时需要与Catenins蛋白结合诱导肌动蛋白发挥作用。Catenins水平降低可以阻断Wnt信号通路，抑制癌细胞的发展。MMP2是一种基质蛋白，在恶性肿瘤的侵袭和转移中具有重要作用，MMP2在癌细胞中表达上调[14]。PTEN是一种抑癌基因，在癌细胞中表达下调。PTEN的缺失和突变是癌症发生的一个标志性事件[15]。本研究中通过细胞划痕实验检测血根碱对宫颈癌细胞迁徙能力的影响，血根碱作用后的宫颈癌细胞的迁徙能力与对照组相比明显下降。经过Transwell小室检测到血根碱可以抑制宫颈癌细胞的迁移能力和侵袭能力，药物浓度越大，抑制能力越强。Western blot检测药物作用后的宫颈癌细胞中E-cadherin、β-Catenin、PTEN、MMP2的表达水平的变化，血根碱可以抑制β-Catenin、MMP2的表达，促进E-cadherin和PTEN的表达，说明E-cadherin、β-Catenin、MMP2、PTEN参与了血根碱抑制宫颈癌细胞的侵袭转移机制。

综上所述，血根碱可以抑制宫颈癌细胞增殖、黏附、迁徙、转移、侵袭能力，抑制能力随着血根碱药物浓度的增加而增加。血根碱可以促进宫颈癌细胞的凋亡。作用抑制机制与E-cadherin、β-Catenin、MMP2、PTEN蛋白有关，为进一步研究血根碱对癌细胞的作用机制奠定了基础，为治疗宫颈癌提供了新的思路和方法。

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Study on effect mechanism of sanguinarine on proliferation,apoptosis,invasion and migration of cervical cancer cells

LiZhencai,JiangPing,WangQiuyu,YangLi,FuPengxiao,ZhangJinru

(DepartmentofGynecology,AffiliatedNanyangCentralHospitalofZhengzhouUniversity，Nanyang,Henan473003,China)

Objective To investigate the effect mechanism of sanguinarine on the proliferation,apoptosis,invasion and migration abilities of cervical cancer cells.Methods MTT,flow cytometer,cell scratch test and Transwell chamber assay were respectively used to detect the cellular proliferation,apoptosis,migration and invasion abilities after sanguinarine action.The expression levels of E-Cadherin,PTEN,β-catenin and MMP2 protein of cervical cancer cells after sanguinarine action were detected by Western blot.Results 0.6,0.8 μmol/L sanguinarine had the inhibitory effect on the proliferation of cervical cancer cells.After 0.8 μmol/L sanguinarine action for 48 h,cervical cancer HeLa and Siha cells apoptosis rate were up to (45.68±2.26)% and(31.89±3.80)% respectively.0.8 μmol/L sanguinarine action for 3 h,cervical cancer cells HeLa and Siha adhesion rates were only (67.45±2.13)% and(73.59±2.61)%.0.8 mol/L sanguinarine action for 16 h,the invasion numbers of cervical cancer Hela and Siha cell were (39.64±1.98) and (43.87±2.83) respectively.The expression amount of E-Cadherin and PTEN in cervical cancer cells after sanguinarine action was increased,while the expression amount of E-Cadherin and PTEN was weakened.Conclusion Sanguinarine has the proliferation inhibiting and apoptosis promoting effect on cervical cancer cells,its mechanism may be related to adhesion protein E-Cadherin,β-catenin and PTEN,MMP2.

uterine cervical neoplasms;sanguinarine;invasion;migration;proliferation

李贞彩(1987-)，主治医师，本科，主要从事妇科疾病的诊治研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.22.005

R737.33

A

1671-8348(2017)22-3039-04

2016-12-19

2017-03-07)