利用酵母单杂交研究AtbHLH112上游调控基因

刘羽佳，孙剑明

哈尔滨商业大学食品科学与工程省级重点实验室

利用酵母单杂交研究AtbHLH112上游调控基因

刘羽佳，孙剑明

哈尔滨商业大学食品科学与工程省级重点实验室

bHLH转录因子是近年来发现的新型转录因子家族，在真核生物的生长发育以及抗逆过程中起重要的调控作用[1]。拟南芥中共有bHLH基因家族成员162个，分别在花器官发生、光信号途径、激素应答和植物次生代谢等过程中扮演了重要的角色。Jiang等发现拟南芥bHLH92基因的过表达，能够有效地提高植物的抗逆胁迫能力[2]。Liu等将拟南芥AtbHLH112转录因子过表达能够有效的提高植物对逆境胁迫的耐受性，从而在非生物胁迫过程中发挥重要的调控作用[3]。我们已从拟南芥bHLH家族中鉴定了一条具有抗旱、耐盐的AtbHLH112转录因子，通过筛选AtbHLH112启动子中抗逆顺式作用元件W-box的结合蛋白，可为深入研究Atb⁃HLH112上游调控基因表达和分子调控机制打下基础。

酵母单杂交技术是鉴定体内DNA与蛋白质识别互作的经典方法，能够有效地分离与特异DNA序列识别结合的蛋白质，同时获得互作基因[4]。本研究利用酵母单杂交系统构建了AtWRKYs基因cDNA文库，筛选获得了与AtbHLH112转录因子启动子中W-box元件特异性识别互作的WRKY蛋白，为进一步研究Atb⁃HLH112上游表达调控基因网络奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

酵母单杂交试剂盒、酵母菌株（Y187）、酵母高纯度质粒快速提取试剂盒、质粒载体（pHIS2、pGADT7-Rec2）均购自日本TaKa⁃Ra公司；大肠杆菌快速质粒提取试剂盒、PCR纯化试剂盒和大肠杆菌感受态（E.coli DH5α）均购自美国OMEGA公司；引物合成、DNA序列合成和测序均委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.2 AtbHLH112基因启动子序列顺式作用元件的预测

通过PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）数据库和PlantCARE数据库（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant⁃care/html/）对AtbHLH112基因起始密码子ATG上游623bp启动子序列（去除5’UTR区域）进行顺式作用元件预测。

1.3 报告载体的构建

1.3.1 寡聚核苷酸链的合成

分别将三次串联的W-box（CTCAA）核苷酸片段（cW-box）、突变W-box（ACACC）核苷酸片段（mW-box）、包含W-box的139 bp启动子片段（sW-box）和缺失W-box的90 bp启动子片段（dW-box）的两端引入pHIS2报告载体相对应的EcoRI和Sac I酶切位点；将合成的正反两条寡聚核苷酸链复性为双链DNA片段；pHIS2质粒分别用EcoRI和Sac I双酶切，酶切完全后纯化回收。

1.3.2 重组载体的构建

分别将复性的双链寡聚核苷酸片段和pHIS2线性载体用T4 DNA连接酶催化连接；电激法将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞后，涂布于LB固体培养基（50 mg/L Kan），37℃倒置培养14～18 h。随机挑取几个单克隆菌斑作模板进行PCR扩增，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并挑选2-3个阳性克隆进行测序，确认所构建的重组报告载体的正确性。

1.4 AtWRKYs基因cDNA文库的构建

图1 报告载体菌液PCR检测

在拟南芥数据库TAIR内查找能够识别W-box元件的12个AtWRKYs同源基因（WRKY2、3、4、9、14、20、26、33、40、58、66、71）用于cDNA文库的构建。根据效应载体pGADT7-Rec2和At⁃WRKYs同源基因的融合特性，在AtWRKYs的两端分别引入SmaI酶切位点。以拟南芥cDNA为模板，利用PCR分别扩增出带有At⁃WRKYs目的片段，纯化回收后即形成AtWRKYs的cDNA文库。

1.5 利用酵母单杂交筛选AtWRKYs基因cDNA文库

将AtWRKYs基因cDNA文库、SmaI单酶切的pGADT7-Rec2线性载体和pHIS2-cW-box共转化酵母Y187感受态细胞。转化后的酵母重悬菌液分别涂布于TDO/3-AT筛选培养基，30℃倒置培养3-5 d。挑取几个不同转化的单克隆酵母菌斑接种于TDO液体培养基（50 mg/L Kan）中，30℃震荡培养12h后，提取酵母质粒。

分别以转化酵母质粒作模板进行PCR扩增检测，能扩增出与AtWRKYs同源基因大小一致的特异片段即为互作的上游调控基因；电激法将酵母质粒转化大肠杆菌感受态细胞，对筛选出的单克隆进行PCR检测并测序，对测序正确的样品抽提质粒。

1.6 利用酵母单杂交验证W-box元件与AtWRKYs基因的互作

分别将pHIS2-mW-box、pHIS2-sW-box、pHIS2-dW-box与pGADT7-Rec2-WRKYs共转化酵母Y187感受态细胞。随机挑取几个不同转化的单克隆酵母菌斑接种于DDO液体培养基（50 mg/ L Kan）中，30℃震荡培养12h后；再分别取2 μL稀释10、100、1000、10000倍的菌液点于TDO/3-AT的固体培养基上进行筛选，30℃倒置培养2～3 d，观察转化酵母的生长状态。

2 结果与分析

2.1 AtbHLH112基因识别顺式作用元件的预测

启动子序列的预测结果表明，AtbHLH112启动子中除了含有CAAT-box、TATA-box等基本元件以外，还含有ARR1TA、GT⁃GANTG10、MYCCONSENSUSAT、MYBCORE、W-boxATNPR1和WRKY71OS等多个与信号传递途径相关以及植物抗逆相关的元件。选取其中抗逆功能较为突出的W-box元件用于上游调控因子的研究。

2.2 报告载体的构建

分别挑取单克隆菌斑进行PCR检测，凝胶电泳结果显示扩增出的DNA片段大小分别与cW-box、mW-box、sW-box和dW-box基因片段大小吻合（图1）；测序结果经序列比对分析后证明重组报告载体构建成功。

2.3 AtWRKYs基因与W-box元件的互作

pHIS2-cW-box与pGADT7-Rec2-AtWRKYs的酵母转化子内的识别情况与互作能力存在较大差异，导致酵母转化细胞在3-AT存在的条件下生长速度不一致。为进一步提高筛选率，随机挑取10个长势好且形状规则的酵母菌斑，二次筛选后抽提酵母质粒，通过PCR鉴定W-box元件与AtWRKYs基因互作情况（图2）。

为验证互作基因的可靠性，将酵母质粒转化大肠杆菌（E.coli DH5α）感受态细胞，分别挑取阳性克隆菌斑再次进行PCR检测并测序。测序列结果用BioEdit软件和blastx比对分析，酵母单杂交分析结果表明，AtWRKY66能够特异性识别W-box元件，且互作能力最强。

图2 pGADT7-Rec2-AtWRKYs互作基因的PCR检测

2.4 AtWRKY66基因识别W-box元件的互作验证

分别将pHIS2-mW-box、pHIS2-sW-box和pHIS2-dW-box与pGADT7-Rec2-AtWRKY66共转化酵母Y187感受态细胞，通过TDO/3-AT（50 mM）的固体培养基上进行二次筛选，结果表明，At⁃WRKY66只能够特异性识别sW-box，而由于组成W-box元件序列的碱基发生了突变或缺失，导致AtWRKY66与mW-box和dW-box间的识别与互作能力消失，因此转化后的酵母细胞在3-AT存在的条件下生长受到严重的抑制（图3）。进一步说明AtWRKY66与W-box元件识别的特异性，同时也说明组成W-box元件的碱基对于上游因子AtWRKY66的识别均起着至关重要的作用。

图3 AtWRKY66与W-box的酵母单杂交分析

3 结果与讨论

WRKY转录因子的N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列，能够通过调节启动子中含W-box基因的表达，从而发挥参与植物的逆境胁迫反应[5]。迄今为止，研究者们已经在拟南芥、水稻、大豆等植物中鉴定了多种WRKY类转录因子基因。Liu等研究发现拟南芥中WRKY18、WRKY40和WRKY60等转录因子能够与脱落酸相应基因ABI4和ABI5启动子序列中的W-box元件识别互作，进而验证了WRKY蛋白介导ABA信号途径机制[6]。本研究成功构建了拟南芥抗逆境胁迫基因AtbHLH112上游启动子区域的W-box元件报告载体，并构建了AtWRKYs同源基因cDNA文库，利用酵母单杂交系统进行了DNA-蛋白质的筛选，确定了W-box结合蛋白的互作情况。实验中利用酵母单杂交技术合成At⁃WRKYs同源基因的cDNA两端融入与效应载体匹配的SmaI酶切位点粘性末端序列，借助同源重组，cDNA文库的构建和互作筛选在酵母Y187细胞内同时进行，实验操作简单且高效，节省了实验时间和成本的同时为进一步研究AtbHLH112上游表达调控基因网络奠定了基础。

[1]Toledo-Ortiz G.,Huq E.,and Quail P.H.（2003）The Arabidop⁃sis basic/helix-loop-helix transcription factor family,The Plant Cell, 15：1749-70.

[2]Jiang,Y.,Yang,B.and Deyholos,M.K.（2009）Functional char⁃acterization of the Arabidopsis bHLH92 transcription factor in abiotic stress[J].Mol Genet Genomics,282（5）：503-16.

[3]Liu,Y.,Ji,X.,Nie,X.,et al.（2015）Arabidopsis AtbHLH112 regu⁃lates the expression of genes involved in abiotic stress tolerance by binding to their E-box and GCG-box motifs.New Phytologist,207（3）：692-709.

[4]Arda,H.E.,Walhout,A.J.M.（2010）Gene-centered regulatory networks[J].Briefings in Functional Genomics,9（1）：4-12.

[5]Nobuaki I.,Hirofumi Y.（2012）Post-translational regulation of WRKY transcription factors in plant immunity[J].Current Opinion in Plant Biology,15（4）：431-7.

[6]Liu Z.Q.,Yan L.,Wu Z.,et al.（2002）Cooperation of three WRKY-domain transcription factors WRKY18，WRKY40，and WRKY60 in repressing two ABA-responsive genes ABI4 and ABI5 in Arabidopsis[J].Journal of Experimental Botany,63（18）：6371-92.

Study on Upstream regulated of AtbHLH112 with Yeast One-hybrid Method

Yujia Liu,Jianming Sun
Key Laboratory of Food Science and Engineering,Harbin University of Commerce

酵母单杂交技术是研究DNA与蛋白质相互作用的经典方法，能够有效地分离鉴定与特异DNA序列识别结合的蛋白质。本研究利用酵母单杂交系统构建了AtWRKYs基因cDNA文库，筛选获得了与拟南芥抗逆境胁迫基因AtbHLH112启动子区域中W-box元件特异性识别互作的WRKY蛋白。结果为进一步研究AtbHLH112上游表达调控基因网络奠定了基础。

拟南芥；AtbHLH112；上游表达调控；酵母单杂交

Yeast one-hybridis a kind of classic methods to study on the interaction between DNA and proteins,which effectively iso⁃lated and identified proteins binding to specific DNA sequences.In this study,we constructed the cDNA library of AtWRKY genes,and obtainedan AtWRKY gene,using yeast one-hybrid analysis,can reg⁃ulate the expression of AtbHLH112 through characteristically recog⁃nizing W-boxcis-element in the promoter of AtbHLH112.The re⁃sults established a foundation for futher research of upstream regulat⁃ed genes which interacted withAtbHLH112.

Arabidopsis；AtbHLH112；Upstream regulated；Yeast one-hybrid

哈尔滨商业大学博士科研启动项目（14LG16）；哈尔滨商业大学校级教学改革与教学研究项目（HSDJY19）。

刘羽佳（1984-），女，讲师，博士。