新抗癌基因p16的分析检测研究进展

王祎杰, 王晓英

(东南大学公共卫生学院，江苏南京 210009)

1 引言

p16基因又称MTS1(Multiple Tumor Suppressor 1)基因、p16INK4(细胞周期依赖性激酶CDK4抑制剂)，是美国冷泉港实验室Kamb等[1]于1994年发现的新抗癌基因，位于9p21，其全长8.5 kb，由2个内含子和3个外显子(126bp、307bp、11bp)间隔组成[2]。编码蛋白质是分子量约为16 kDa的单链多肽，故称其为p16基因。

p16基因的表达产物(p16蛋白)可抑制CDK4(细胞周期蛋白依赖性激酶)介导的Rb蛋白磷酸化，其与cyclinD1竞争结合CDK4，致使CDK4正向作用和Rb蛋白磷酸化过程受阻，具活性的Rb蛋白可抑制DNA合成所必需的转录因子等酶的表达[3]。当p16基因失活时，cyclinD1过表达结合CDK4，使Rb蛋白磷酸化，导致其与转录因子(E2F)解离[4]，处于游离态的E2F激活一系列可促使细胞进入S期并进行DNA复制的蛋白表达，进而促使细胞增殖[5]。

研究显示，p16基因已在肺癌[6]、乳腺癌[7]、皮肤癌[8]、胃癌[9 - 10]、肾癌[2,11]、卵巢癌[12 - 13]、咽喉癌[14]、淋巴瘤[15]及黑色素瘤[16]等中发现纯合子缺失，无义、错义及移码突变，表明p16基因以缺失、突变的方式广泛参与肿瘤的形成。检测p16基因有无改变，对判断患者肿瘤的易感性及预测肿瘤的预后具有十分重要的临床意义。本文主要对近年来p16基因相关检测技术的原理、方法及进展作一简要综述。

2 传统检测技术的应用

在过去的几十年里，p16基因已逐渐成为遗传学研究的热点。传统的DNA检测方法包括突变检测(直接法和间接法)及甲基化检测。

2.1 基因突变检测

2.1.1直接法直接法即应用分子生物学技术，根据遗传病的致病基因类型直接对其进行突变检测，以确定受诊者是否携带致病基因，进而确定是否患病，常见方法有DNA直接测序法(Direct Sequencing，DS)[17]、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction-restricted Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)[18]、变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)[19]、单链构象多态性(Single-stranded Conformation Polymorphism，SSCP)[20]等。上述几种突变检测方法的比较见表1。

表1 p16基因突变传统检测方法比较Table 1 Traditional methods for detection of p16 gene mutation

2.1.2间接法间接法即根据p16蛋白(在多种肿瘤组织中呈过度表达)间接判断p16基因是否存在点突变，通过应用特异性抗体与其产物蛋白结合产生抗原抗体反应，常见方法有免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)[21,22]、酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)[23]、半导体(Semiconductor)技术[24]等。由于在不同切片组织中，抗原修复、抗体浓度、培育温度及时间等的不同，造成不同批次的结果存在差异，进而导致假阳性和假阴性错误的发生。

2.2 DNA甲基化检测

肿瘤组织中常出现甲基化异常的现象，主要是基因组普遍低甲基化(如癌基因)和局部区域高甲基化(如抑癌基因)，异常甲基化(高或低)会影响细胞分裂的生理稳定性[25 - 27]。常见的甲基化检测方法有甲基化敏感的单核苷酸扩增(Methylation-sensitive Single Nucleotide Primer Extension，MS -SNuPE)[28]、变性高效液相色谱(Denaturing High Performance Liquid Chromatography，DHPLC)[29]、甲基化特异性PCR(MS -PCR)[30 - 31]等。上述几种甲基化检测方法的比较见表2。

表2 DNA甲基化常见检测方法比较Table 2 Comparison of common test methods of DNA methylation

3 生物传感技术的应用

生物传感技术是一种对生物物质敏感并将其浓度转换为光电信号进行检测的高新技术，是由固定化的生物敏感材料作识别元件(酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质)、适当的理化换能器(氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等)及信号放大装置构成的分析工具或系统。目前，根据理化换能器的不同，常见的抗癌基因p16生物传感器主要有光学、压电和电化学等类型。

3.1 光学生物传感技术

3.1.1荧光共振能量转移Feng等[32]利用阳离子共轭聚合物(Cationic Conjugated Polymer，CCP)建立荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)的方法检测p16基因甲基化。该方法效率高，操作过程可避免引物标记、分离纯化的需要，成本低。但高灵敏的FRET生物传感器设计困难，存在背景噪音需校正。

3.1.2表面等离子体共振表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)是将一种具有特异识别能力的分子即配体固定于金属膜表面，监控溶液中被分析物与配体的结合，检测复合物形成或解离过程中金属膜表面溶液的折射率变化。Nand等[33]应用SPR结合原位蛋白微阵列技术对CDK4-p16进行蛋白质相互作用的研究。该方法简单快速、成本低，但其灵敏度有限，测量范围与物质的分子量有关。

3.2 压电生物传感技术

压电免疫传感器是由压电晶体及其表面固定化的抗原或抗体构成，是在两交互的生物分子间发生生物特异性反应，并产生微小质量变化或频率改变。Yang等[34]将晶体固定在Au电极间，构建压电免疫传感器快速检测p16基因的表达。实验取不同宫颈细胞的上清液并检测不同浓度的p16INK4a，检测的范围为50～1 200 ng/mL，检测限为10 ng/mL，分析时间小于30 min。此方法耗时短、重现性和稳定性良好(4 ℃,8周)、特异性高，但蛋白A经PBS洗去残余后易引起其失活，影响抗体的固定效果。

3.3 电化学生物传感技术

3.3.1基于共价键固定法的非标定型电化学检测Ge等[35]运用非标定型伏安法经戊二醛(GA)共价偶联2-氨基乙硫醇(AET)修饰Au电极检测p16基因。在电位控制下通过形成席夫碱，使氨基修饰的DNA探针成功组装在GA耦合表面，然后将DNA探针与目标DNA进行杂交反应。实验表明，共价键合法固定DNA探针较稳定、耐用、特异性高，且对杂交反应中无标记的单碱基错配目标DNA的电化学检测具高灵敏性。

3.3.2基于双重信号协同放大电化学免疫传感器Duangkaew等[36]应用双位点夹心法构建三明治结构，将碳纳米管(CNT)掺杂壳聚糖(Chitosan)结合戊二醛(GD，25%水溶液)修饰丝网印刷电极(SPCE)构建生物传感界面，捕捉抗体(Ab1)与谷胱甘肽S转移酶-p16(GST-p16)重组蛋白、金纳米粒子(Au NPs，粒径15 nm)标记捕获抗体(Ab2)反应，经Au、Ag依次沉积实现双重信号放大。其线性范围为15.6～250 ng/mL，检测限为1.3 ng/mL。该方法与Yang等[34]利用压电免疫传感器检测p16相比，灵敏度提高了近8倍。

3.3.3电化学传感与PCR联用由于肿瘤组织、血样等实际生物样本基底组成复杂，直接检测干扰严重，若进行DNA抽提，一般碱基序列较长，常采用人工合成片段，且有时会结合PCR效果更好。Hou等[37]运用合成的寡合苷酸修饰Au电极构建DNA生物传感器，将AET固定于电极表面，可占据未被DNA分子作用的位点，避免碱基与Au电极的非特异性作用，结合linker-PCR对人类胃癌组织及健康人血细胞p16INK4a基因5′-CpG岛甲基化状态进行成功测定。Xu等[38]将横流核酸生物传感器(Lateral Flow Nucleic Acid Biosensor，LFNAB)与比例竞争性定量PCR(Proportion Competitive Quantitative PCR，PCQ-PCR)结合对小鼠血浆中的p16基因多甲基化位点进行测定，甲基化水平的回收率均在94%以上。

电化学生物传感技术在实际应用中效果较好，但传感器的灵敏度、重现性、稳定性仍有待提高。可利用PCR扩增，筛选高灵敏高选择性的复合型杂交指示剂，选用双或三嵌合剂代替单嵌合剂，结合纳米材料(金、银胶，量子点等)放大信号，优化电极表面结构提高灵敏度。DNA杂交过程选择最佳温度(不完全匹配的DNA链高温下难稳定存在)来提高选择性。可在无杂交指示剂或标记物下，根据杂交后DNA分子中鸟嘌呤电化学信号的变化或因杂交造成传感界面状态改变而引起某些电化学参数的变化对DNA直接检测以简化操作。几种重要的p16生物传感技术的分析性能的比较见表3。

表3 不同p16检测技术的分析性能比较Table 3 Comparision for analytical performance of multiple detection technologies of p16 gene

(续表3)

MethodsCharacteristicDetection limitDetection timeSimple levelReferenceElectrochemical immunosensor Construction of sandwich structure with covalent bond,dual signal amplifica-tion by Au and Ag deposi-tion,high selectivity(2-fold)1.3 ng/mLMinutesSimple operation,con-struction of sensor plat-form with short time,detect real samples rap-idly and sensitively[36]

4 p16基因检测技术的展望

目前有关p16基因的检测方法越来越多，但各种方法均存在优缺点。但从整体看，电化学生物传感技术这个新领域在p16基因检测方面的应用有着较为广阔的前景。就现有研究而言，需进一步了解p16与多种肿瘤的相关性，研究它及其表达产物与生物活性物质结合后在早期诊断、疗效评估、鉴别诊断及预后判断等方面的协同关系。在完善自身检测技术的同时，结合其它技术如光学、电学、生物医学等，实现各技术间的优势互补。随着研究工作的深入，p16基因诊断和治疗有望成为一种应用前景良好的肿瘤诊断和治疗方法。