利用SRAP标记快速检测西瓜杂交种子纯度

韩宏伟，王 浩，佘建华，王 强，庄红梅，刘会芳，李 宁

(新疆农业科学院园艺作物研究所，乌鲁木齐 830011)

利用SRAP标记快速检测西瓜杂交种子纯度

韩宏伟，王 浩，佘建华，王 强，庄红梅，刘会芳，李 宁

(新疆农业科学院园艺作物研究所，乌鲁木齐 830011)

目的以设施、露地兼用西瓜杂交品种早佳(84-24)及其父本、母本为试验材料，利用SRAP分子标记技术进行DNA指纹图谱构建，筛选出能够快速检测西瓜早佳(84-24)杂交种子纯度的SRAP标记。方法选取28对SRAP引物，对供试西瓜品种早佳(84-24)及其父、母本的基因组DNA进行扩增，筛选出扩增多态性好、条带清晰、稳定的SRAP引物作为候选标记，利用100粒杂交种子进行纯度检测准确性验证。结果28对供试引物中有22对引物在F1及其父、母本之间扩增出多态性条带，多态性比率为78.6%，其中有1对为父本显示，母本缺失的显性SRAP引物(Me6F/ Em2R)。用显性引物(Me6F/ Em2R)对100粒西瓜杂交种子进行纯度检测，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，纯度为99.0%，与田间形态学鉴定结果(99.1%)基本一致。结论利用SRAP标记(Me6F/ Em2R)，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，可以对西瓜杂交种早佳(84-24)的纯度进行快速、准确鉴定。SRAP分子标记技术在西瓜杂交种子纯度室内快速检测中有很大的应用前景。

西瓜；SRAP标记；杂交种子纯度；快速检测

0 引 言

【研究意义】纯度是种子质量的重要指标，也是种子分级的主要依据[1]。种子质量的优劣直接影响农产品质量和优良品种的增产潜力。目前西瓜杂交种子纯度检测主要以田间种植鉴定为主。不仅鉴定周期较长，且易受外界环境及人为因素的影响，结果并不十分可靠，快速、准确的鉴定西瓜杂交种子纯度已显得十分有必要。【前人研究进展】近年来随着分子标记技术的发展，使西瓜杂交种纯度快速鉴定成为可能。人们相继开展了扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)技术、随机扩增多态性DNA标记(random amplified polymorphism DNA,RAPD)技术、简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)技术等在西瓜种子纯度鉴定中应用研究[2]。因受技术本身的特点限制，并没有在生产上得到广泛应用。AFLP技术需要较高的试验技能和高精度的仪器设备，难以普及推广。RAPD技术虽然操作简单、经济快捷、多态性高，应用范围广，但对药品、反应条件、操作等要求极为苛刻，扩增具有随机性，结果重复性较低，限制了该技术的应用。而设计SSR引物需要对SSR位点进行分子克隆和 DNA 序列分析，给SSR 技术的开发和利用带来了一定的困难。SRAP(Sequence-related amplified polymorp-hism)，相关序列扩增多态性，是一种新型的基于PCR的标记，由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros[3]于2001年提出，SRAP的原理是利用独特的引物设计对 ORFs(open reading frames)进行扩增，上游引物长17 bp，5’端的前10 bp是一段填充序列，紧接着是CCGG，组成核心序列及3’端3个选择碱基，对外显子进行特异扩增。SRAP操作简便、扩增结果稳定、高效、重复性好等优点，已经被应用于图谱构建[4]、比较基因组学、遗传多样性分析、基因连锁标记开发及基因定位[5,6,7]和比较基因组学[7]的研究中。中国近年来关于SRAP分子标记在种子纯度检测中的应用已有很多，例如在西瓜[8]、瓠瓜[9]、花生[10]等作物上的运用。刘泽发等[8]研究结果表明，引物对E2/M5在红小玉杂交种和亲本间扩增出品种特异性条带，适合在室内快速准确地进行杂交种的纯度鉴定，试验结果与大田鉴定结果吻合率高。张建成等[10]研究了分属3个市场型的10个中国花生栽培种的序列相关扩增多态性( SRAP)，结果表明SRAP技术可以揭示花生栽培种的遗传差异。郭庆华[11]利用 SRAP 标记技术，在两亲本及基因池间筛选45对引物，通过单株验证，获得与红花苞叶刺性状连锁的1个SRAP标记(M3E3)。根据苞叶是否有刺以及是否扩增出的特异性条带，计算出该标记和有刺红花基因之间的交换值为 11.4%，说明两者之间紧密连锁。从片段的精确长度和碱基组成，认为红花苞叶刺性状紧密连锁的SRAP标记M3E3可作为无刺红花品种选育的辅助分子标记。【本研究切入点】利用SRAP标记技术进行杂交种子纯度鉴定、遗传差异分析及品种辅助选择方面已有较多研究，但在西瓜杂交种子纯度鉴定的研究报道较少，研究拟以西瓜杂交种早佳(84-24)及其父本、母本为试材，利用SRAP标记技术，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，筛选出能够快速检测西瓜早佳(84-24)杂交种子纯度的SRAP标记。【拟解决的关键问题】研究利用SRAP标记技术，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以西瓜杂交种早佳(84-24)及其父本、母本为试材，筛选出能够快速检测西瓜早佳(84-24)杂交种子纯度的SRAP标记。为西瓜杂交种早佳(84-24)种子纯度的快速、准确检测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为西瓜杂交种早佳(84-24)及其父本、母本种子，由新疆农业科学院园艺作物研究所提供。PCR所用的SRAP引物、dNTPs、TaqDNA酶、过硫酸铵、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、琼脂糖、Tris、EDTA-Na2·2H2O等生化试剂均购于生工生物工程(上海)股份有限公司；其它试剂均为进口或国产分析纯。表1

1.2 方 法

1.2.1 供试材料DNA提取

将供试西瓜杂交种早佳(84-24)F1代及其父本、母本种子在新疆农业科学院安宁区综合试验场播种，开花坐果后根据果皮形态特征，分别采集F1、父本和母本植株的幼嫩叶片，用于DNA提取，方法采用改良的CTAB法[12]；从供试西瓜杂交种早佳(84-24)F1代种子样品中随机选取100粒，用于SRAP标记检测的准确性验证，DNA提取参考姜陆[13]的方法。

1.2.2 SRAP多态性标记的筛选与扩增

SRAP-PCR反应体系(25 μL)：DNA(50 ng/μL)1 μL，2×TaqMaster Mix 12.5 μL，引物(10 μmol/L)各1 μL，加无菌水至25 μL。PCR反应程序：94℃预变性4 min，94℃变性40 s，35℃复性40 s，72℃延伸90 s，5个循环；94℃变性40 s，50℃复性40 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存；扩增产物用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

2 结果与分析

2.1 多态性SRAP标记筛选

选取的28对SRAP引物组合对早佳F1代及其父本、母本基因组DNA进行多态性扩增，产物经6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果表明，有22对引物在F1代及其父本、母本之间扩增出多态性条带，多态性比率为78.6%。其中引物Me6F/ Em2R(5’-TGAGTCCAAACCGGGCT-3’/ 5’- GACTGCGTACGAATTAAT-3’)为显性标记，表现为父本和F1代扩增出230 bp的特异性条带，母本则无此条带。图1

表1 供试SRAP引物组合及序列信息
Table 1 The No. and sequence of SRAP primers used in the experiment

引物序号PrimersNo．引物组合Primerspairs正向引物序列5’-3’Forwardprimerssequence5’-3’反向引物序列5’-3’Reverseprimerssequence5’-3’1Me1F/Em1RTGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTATT2Me1F/Em2RTGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTAAT3Me1F/Em3RTGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTTGC4Me1F/Em5RTGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTTGA5Me1F/Em6RTGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTAAC6Me3F/Em1RTGAGTCCAAACCGGATGGACTGCGTACGAATTATT7Me3F/Em2RTGAGTCCAAACCGGATGGACTGCGTACGAATTAAT8Me3F/Em3RTGAGTCCAAACCGGATGGACTGCGTACGAATTTGC9Me3F/Em5RTGAGTCCAAACCGGATGGACTGCGTACGAATTTGA10Me3F/Em6RTGAGTCCAAACCGGATGGACTGCGTACGAATTAAC11Me4F/Em1RTGAGTCCAAACCGGACAGACTGCGTACGAATTATT12Me4F/Em2RTGAGTCCAAACCGGACAGACTGCGTACGAATTAAT13Me4F/Em3RTGAGTCCAAACCGGACAGACTGCGTACGAATTTGC14Me4F/Em5RTGAGTCCAAACCGGACAGACTGCGTACGAATTTGA15Me4F/Em6RTGAGTCCAAACCGGACAGACTGCGTACGAATTAAC16Me4F/Em7RTGAGTCCAAACCGGACAGACTGCGTACGAATTGCA17Me6F/Em1RTGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTATT18Me6F/Em2RTGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTAAT19Me6F/Em3RTGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTTGC20Me6F/Em5RTGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTTGA21Me6F/Em6RTGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTAAC22Me6F/Em7RTGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTGCA23Me7F/Em1RTGAGTCCAAACCGGTAAGACTGCGTACGAATTATT24Me7F/Em2RTGAGTCCAAACCGGTAAGACTGCGTACGAATTAAT25Me7F/Em3RTGAGTCCAAACCGGTAAGACTGCGTACGAATTTGC26Me7F/Em5RTGAGTCCAAACCGGTAAGACTGCGTACGAATTTGA27Me7F/Em6RTGAGTCCAAACCGGTAAGACTGCGTACGAATTAAC28Me7F/Em7RTGAGTCCAAACCGGTAAGACTGCGTACGAATTGCA

注：M为Marker DL2000；泳道1～36分别为引物组合17～28对供试杂交种的父本、母本和F1的扩增结果

Note: M:Marker DL2000; Lane 1-36: The amplification of paternal、 female and hybrid seed of Zaojia(84-24) by using A-L SRAP marker, respectively

图1 西瓜杂交种早佳(84-24)部分多态性SRAP引物筛选
Fig.1 SRAP primers selection in watermelon hybrid of Zaojia(84-24)

2.2 西瓜早佳(84-24)杂交种子纯度的鉴定

用SRAP引物(Me6F/ Em2R)对100粒西瓜早佳(84-24)杂交种子进行群体验证，研究表明，100粒供试杂交种子中有99份扩增出了230 bp特异性条带，只有泳道2的带型与图1中泳道8(母本)一致，被鉴定为假杂种，即供试西瓜杂交种子的纯度为99.0%。供试西瓜杂交种早佳(84-24)F1代种子样品在田间形态学鉴定中表现为，216株供试植株中有2个(母本自交株)假杂株，纯度为99.1%，与SRAP标记分子检测的结果基本一致。图2

注：M1为Marker DL2000，M2为Marker B；泳道1～35为引物(Me6F/ Em2R)对部分供试杂交种子的扩增结果

Note: M1:Marker DL2000; M2:Marker B; Lane 1-35: The amplification of hybrid seed of Zaojia(84-24) by using Me6F/ Em2R SRAP marker

图2 SRAP标记(Me6F/ Em2R)对西瓜早佳(84-24)杂交种子的扩增产物
Fig.2 SRAP profile of Zaojia(84-24 ) hybrid amplified with primer C(Me6F/ Em2R)

3 讨 论

在西瓜杂交制种过程中，导致杂交种子中含有母本自交苗(假杂种)的主要原因是母本雌花隔离不彻底或授粉不及时。目前生产上对西瓜杂交种子纯度的鉴定主要采用田间形态学鉴定的方法，即根据F1代杂交种与其母本之间在果实皮色、种皮颜色、叶片形状等形态学上的差异来区分真假杂交种。早佳(84-24)F1杂交种与其母本之间形态学上的最大区别在于果实皮色，表现为F1杂交种果皮为绿底墨绿色实心条带，而母本果皮则为浅绿底核桃纹形条带，生产中常以此作为检测早佳(84-24)真假杂交种的形态学标记。采用此方法需要将待检测样品田间播种，正常开花坐果后才能得出鉴定结果，且新疆无霜期较短，当年生产的杂交种子往往次年才能进行纯度鉴定，或需要在南方进行异地鉴定，不仅鉴定周期较长，成本也较高。

研究筛选出的1对显性SRAP标记(Me6F/ Em2R)，PCR扩增后经6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，能够快速、准确的区分西瓜早佳(84-24)杂交种和母本自交苗(假杂种)，可以用来进行杂交种子纯度检测。采用此方法，一个熟练的技术人员可以在一个工作日内完成约 100 份样品 DNA 的提取、PCR的扩增以及扩增产物的电泳检测，使西瓜杂交种子纯度的检测效率大大提高，且更加的经济和准确。

4 结 论

供试28对SRAP引物中有22对引物在西瓜杂交种早佳(84-24)及其父本、母本之间扩增出多态性条带，多态性比率为78.6%，其中引物组合(Me6F/ Em2R)为显性SRAP标记。利用SRAP标记(Me6F/ Em2R)，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳对100份西瓜早佳(84-24)杂交种子纯度进行检测，其杂交种子纯度为99.0%，与田间形态学鉴定结果(99.1%)基本一致；西瓜杂交种早佳(84-24)种子纯度可以利用SRAP标记(Me6F/ Em2R)结合6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，进行室内分子快速检测，且检测效率及准确率较高。

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Abstract：【Objective】 To screen out one SRAP marker to detect seed purity，the watermelon hybrids of Zaojia (84-24) and its paternal and female lines were used to study the polymorphorrism of amplifiable spectral bands.【Method】Polymorphic primer pairs were selected from 28 SRAP primer pairs for Zaojia (84-24) hybrids and their parents in this experiment. The SRAP primers with good polymorphism, clear bands and s
Table primers were selected as candidate markers, and the purity of the 100 hybrid seeds was tested and verified.【Result】The results showed that 28 pairs of primers had 22 pairs of primers, and polymorphic bands were amplified between F1and its parents. The ratio of polymorphism was 78.6%, among which, there was only one pair of complementary type SRAP primer(Me6F/ Em2R)with male display and lack of female parent, The result showed the purity of hybrid seeds was 99.0%, which was basically the same as the field morphological identification (99.1%).【Conclusion】SRAP primer (Me6F/Em2R), in combination with Polyacrylamide gel electrophoresis can be used to detect the purity of Zaojia (84-24) hybrid seed rapidly and accurately. There is a great prospect of application in using this method.

Keywords: watermelon; SRAP molecular marker; hybrid seed purity; rapid detection

UsingSRAPMarkersforRapidDetectionofZaojia(84-24)WatermelonHybridSeedPurity

HAN Hong-wei, WANG Hao, SHE Jian-hua, WANG Qiang, ZHUANG Hong-mei,LIU Hui-fang, LI Ning

(ResearchInstituteofHorticulturalCrops,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China)

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.09.007

S651

A

1001-4330(2017)09-1621-06

2017-07-05

新疆维吾尔自治区公益性科研院所基本科研业务费专项“蔬菜品种收集引进及筛选利用研究”(KYGY2016119)；新疆农业科学院青年基金项目“基于SRAP标记的西瓜杂交种早佳(84-24)纯度的快速检测体系构建”(xjnkq-2015008)

韩宏伟(1986-)，男，河南人，助理研究员，研究方向为特色瓜菜种质资源创新与新品种选育，(E-mail)hhwei2010@sohu.com

王浩(1970-)，男，山东人，研究员，研究方向为蔬菜栽培与生理，(E-mail)Wanghao183@163.com

Supported by: The Basic Research Funding for the Public Welfare Research Institutes of Xinjiang Uygur Autonomous Region "Study on Collection, Introduction and Selection of Vege
Table Germplasm" (KYGY2016119); The Youth Fund Project of Xinjiang Academy of Agricultural Sciences "The Construction of Rapid Detection System to Detect the Purity of Zaojia 84-24 Watermelon Seed by SRAP Markers (xjnkq-2015008)

Corresponding author：WANG Hao(1970-), Professor，Bachelor of Agriculture, Vege
Table cultivation and physiology. (E-mail) Wanghao183@163.com