小檗碱对人卵巢癌细胞SKOV3增殖及凋亡机制的研究

王 婉 张 帆 袁 慧 杨文静

(江汉大学附属医院(武汉市第六医院)妇产科，武汉 430015)

小檗碱对人卵巢癌细胞SKOV3增殖及凋亡机制的研究

王 婉 张 帆 袁 慧①杨文静

(江汉大学附属医院(武汉市第六医院)妇产科，武汉 430015)

目的探讨小檗碱对人卵巢癌细胞(SKOV3)增殖及凋亡的影响。方法MTT法检测细胞增殖；流式细胞仪Annexin V/PI双染色法和透射电子显微镜检测细胞凋亡情况；甲基化特异性PCR分析hMLH1基因启动子区CpG岛的甲基化状态；实时荧光定量RT-PCR检测Bcl-2、Bax、Survivin和hMLH1 mRNA基因的表达。结果小檗碱对卵巢癌SKOV3细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.05)，呈剂量和时间依赖性。当与顺铂联用时，小檗碱对卵巢癌细胞有协同抗癌作用。小檗碱可明显诱导SKOV3细胞凋亡，并下调Bcl-2、Survivin基因及上调Bax基因的表达。此外，小檗碱能恢复hMLH1启动子的甲基化状态及增强hMLH1 mRNA的表达。结论小檗碱可抑制卵巢癌细胞增殖及诱导细胞凋亡，小檗碱可协同增强抗癌药物顺铂的抗肿瘤作用。

小檗碱；甲基化；错配修复基因；卵巢癌SKOV3细胞

卵巢癌是最常见的三种妇科癌症之一，发病率和死亡率都极高[1]。由于缺乏可靠的早期诊断方法，当卵巢癌被确诊时，通常都是晚期。对于晚期卵巢癌患者，化疗是必要的治疗方法之一，而常用的化疗药物铂类组合，因其耐药性和严重的副作用是患者获得满意疗效的首要障碍[2]。因此寻找一种低毒性的抗卵巢癌药物是目前急需解决的问题。

近年来，很多中药已被证实能通过影响细胞周期而诱导癌细胞凋亡，具有一定的抗肿瘤作用，但中药的抗肿瘤作用可能还有更复杂的机制参与。常见癌变过程中启动子甲基化是导致许多肿瘤抑制基因沉默的重要机制。另外，CpG岛甲基化逆转可以恢复抑癌基因的功能，这也是有些中药逆转癌细胞耐药的可能机制[3]。而错配修复系统纠正DNA复制错误，降低自发基因突变率，可保持微卫星位点的稳定性，保持整个基因组的完整性。错配修复基因的突变可以诱导错配修复缺陷，降低遗传稳定性，从而增加癌症的易感性。错配修复基因hMLH1是错配修复系统识别DNA错配位点的重要成员。许多研究表明， hMLH1基因启动子CpG岛异常甲基化对卵巢癌的发展起着至关重要的作用。

从黄连和黄柏中提取的小檗碱用于清热解毒及保护胃肠道免受感染已经有数百年历史。近年有研究报道小檗碱可以抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡[4，5]。本研究通过流式细胞检测及透射电镜观察以及实时荧光定量PCR等方法，探讨小檗碱对人卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1材料 小檗碱(山西太原药业有限公司，批号：150704)；顺铂(齐鲁制药有限公司，批号：140903)；卵巢癌SKOV3细胞株购于上海中国科学院细胞库;DCFH-DA(2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐)荧 光 探 针 购 自 Invitrogen 公 司(美 国);AnnexinⅤ-FITC购自南京铂优公司；胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物工程材料有限公司，杭州，中国)；RPMI1640培养液(Gibco，CA，美国)；UNIQ-10柱型动物基因组提取试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司，上海，中国)；EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo研究所，CA，美国)；HotStartTMTaq(TaKaRa公司，大连，中国)；Trizol试剂(Invitrogen公司，CA，美国)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将人卵巢癌SKOV3细胞接种于75 cm2培养瓶，用含10% FBS的RPMI1640培养基于37℃、5% CO2的培养箱培养，待细胞铺满瓶壁，用1 ml胰酶消化传代。

1.2.2MTT法检测小檗碱对SKOV3细胞的增殖抑制作用 取对数生长期的细胞接种于96孔板中(7 000个细胞/孔)，孵育过夜，分为空白组(只含培养液，不加药物)、小檗碱组(在培养液中分别加入12.5、25、50、100和200 μmol/L的小檗碱)、顺铂组(在培养液中分别加入2.5、5、10 mg/L的顺铂)、小檗碱联合顺铂组(在培养液中分别加入12.5、25、50 μmol/L的小檗碱，以及2.5、5、10 mg/L的顺铂)，孵育24、48和72 h，吸除培养液，更换500 μg/ml的MTT，37℃孵育4 h，洗涤后加入DMSO 200 μl，充分混匀溶解，在酶标仪波长570 nm处检测各组吸光度(A)。抑制率=[1-A(药物组)/A(对照组)]%。计算顺铂的IC50及顺铂联合小檗碱的IC50。所有实验重复3次。

1.2.3流式细胞仪检测小檗碱对SKOV3细胞的促凋亡作用 取对数生长期的SKOV3细胞，分别加入100、200 mmol/L的小檗碱处理48 h，同时设立对照组(仅加入培养基)。48 h后，胰酶消化，PBS漂洗两次，调整浓度为1×106个/ml。取100 μl细胞悬液，加入5 μl Annexin V-FITC 和10 μl PI在常温暗室内共孵育10 min，然后加入400 μl PBS，通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.4透射电子显微镜观察小檗碱对SKOV3细胞的凋亡病变 取对数生长期的细胞，按1.2.3的方法处理细胞。收集细胞，用2.5%戊二醛和1%四氧化锇固定，环氧丙烷脱水和树脂镶嵌。薄片(约60 nm)用醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，通过透射电子显微镜观察小檗碱引起的细胞凋亡病变。

1.2.5甲基化特异性PCR检测小檗碱对SKOV3细胞中hMLH1的去甲基化 取对数生长期的细胞，按1.2.3的方法处理细胞。DNA采用UNIQ-10柱型动物基因组提取试剂盒提取。DNA的质量是通过测量OD260/280 nm的光密度比值验证。

采用EZ DNA甲基化试剂盒进行亚硫酸氢钠修饰并立即进行PCR实验。50 μl的PCR反应体系中包括0.4 μl HotStartTMTaq，5 μl 10×PCR缓冲液，4 μl dNTPs，1 μl的上游引物，1 μl的下游引物，2 μl DNA模板和36.6 μl蒸馏水。反应条件：95℃ 20 min 预变性，95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 45 s，反应40个循环， 72℃延伸10 min，-20℃保存PCR产物。PCR产物(10 μl)经3%琼脂糖凝胶电泳分离。从人外周血淋巴细胞中提取并经过SssI甲基转移酶处理的DNA作为阳性对照。在阴性对照中，水被用来取代DNA。hMLH1基因引物由上海博亚公司合成。

1.2.6实时荧光定量RT-PCR检测小檗碱诱导SKOV3细胞凋亡的机制 取对数生长期的细胞，按1.2.3的方法处理细胞。采用Trizol试剂提取总RNA，通过测定OD260/280 nm的光密度比值评估RNA质量。总RNA反转录成cDNA使用PrimeScript RT试剂盒基因(TaKaRa公司，大连，中国)。两步实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)如下：95℃初始变性30 s，接着40次循环，95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，每个实验重复三次。目标基因的ΔCT值通过比较2-ΔΔCT法和归一化后的管家基因β-肌动蛋白的ΔCT值得出。引物由上海博亚公司合成(表1)。

2 结果

2.1小檗碱抑制SKOV3细胞的增殖 MTT法检测结果表明，小檗碱抑制SKOV3细胞增殖呈现剂量-时间依赖性(如图1)。由图1所示，以小檗碱处理SKOV3细胞24 h，25、50、100、200 μmol/L的小檗碱对细胞生长的抑制率明显高于12.5 μmol/L的小檗碱(P<0.05)，高浓度的小檗碱具有更显著的抑制作用(P<0.05)；而同一浓度的小檗碱处理SKOV3细胞48 h、72 h对细胞生长的抑制率也明显高于处理后24 h(P<0.05)。顺铂联合小檗碱处理SKOV3细胞48 h的IC50为2.78 mg/L，明显低于单用顺铂的7.34 mg/L(P<0.05，表2)。顺铂联合小檗碱组对卵巢癌SKOV3细胞生长的抑制率显著高于单用顺铂组(P<0.05)。本结果表明，小檗碱可抑制SKOV3细胞的增殖，顺铂联合小檗碱对SKOV3细胞的抑制作用明显强于单用顺铂。

2.2小檗碱对SKOV3细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果表明(图2)，与对照组细胞相比，SKOV3细胞暴露于100 μmol/L或200 μmol/L的小檗碱48 h后，细胞凋亡明显增加。48 h后100和200 μmol/L小檗碱导致的凋亡细胞数分别为(52.8±0.06)%和(62.3±0.11)%，与对照组的(1.14±0.072)%相比具有统计学差异(P<0.05),见图2。

表1 各扩增引物序列表

图1 不同浓度小檗碱对SKOV3细胞增殖的影响Fig.1 Proliferation effect of SKOV3 cells induced by different concentrations of berberine

细胞凋亡实验进一步通过透射电镜分析验证，如图3所示。在未经处理的SKOV3细胞中，可以看到完整的细胞膜和细胞器，大的不规则的细胞核，核仁清晰可见，未见染色质浓缩。而用100 μmol/L、200 μmol/L的小檗碱处理48 h后，可见细胞收缩、细胞膜损伤、细胞核高浓缩片段，也可见细胞核固缩、碎裂等核皱缩和空泡化等现象。

2.3小檗碱诱导SKOV3细胞中hMLH1基因启动子CpG岛的去甲基化 甲基化特异性PCR检测结果如图4所示，hMLH1基因启动子区CpG岛(甲基化和非甲基化CpG岛存在)在卵巢癌SKOV3细胞以半甲基化存在。小檗碱(100或200 μmol/L)处理48 h能诱导hMLH1基因启动子CpG岛去甲基化，并且呈现出剂量依赖性。

2.4小檗碱诱导SKOV3细胞凋亡的机制 实时荧光定量RT-PCR检测结果见表3。与未用小檗碱组相比，经100、200 μmol/L小檗碱处理SKOV3细胞48 h后，Bcl-2及Survivin mRNA表达减少，Bax及hMLH1 mRNA的表达增加(P<0.05)，呈现剂量依赖性。

表2 小檗碱联合顺铂对SKOV3细胞增殖的影响

Note：Compared with cisplatin group，1)P<0.05.

图2 小檗碱对SKOV3细胞凋亡的影响Fig.2 Apoptosis effect of SKOV3 cells induced by berberineNote:A.Control group;B.100 μmol/L berberine;C.200 μmol/L berberine.Quadrant Ⅰ.Early necrosis;quadrant Ⅱ.Late necrosis;quadrant Ⅳ.Early apoptosis;Quadrant Ⅲ.Living cells.

表3 小檗碱对SKOV3细胞相关mRNA表达的影响

Note：Compared with 0 μmol/L berberine，1)P<0.05;compared with 100 μmol/L berberine，2)P<0.05.

图3 透射电镜分析小檗碱对SKOV3细胞的影响Fig.3 Effect of SKOV3 cells induced by berberine through transmission electron microscope(TEM)Note:A.Control group cells(× 3 000);B.100 μmol/L berberine(×5 000);C.200 μmol/L berberine(×4 000).

图4 小檗碱诱导SKOV3细胞中hMLH1基因启动子CpG岛的去甲基化Fig.4 hMLH1 gene promoter CpG island demethylation SKOV3 cell induced by berberineNote:U.Unmethylation;M.Methylation;MK.Marker;P.Positive control;1.0 μmol/L berberine;2.100 μmol/L berberine;3.200 μmol/L berberine.

3 讨论

顺铂是临床常用的化疗药物，但其明显的毒副作用影响到临床治疗效果。有研究表明随着顺铂剂量的增加，其毒副作用也明显增加[6，7]。本研究通过MTT法检测结果表明，中药提取物小檗碱可明显抑制人卵巢癌细胞SKOV3增殖，且以剂量依赖性和时间依赖性抑制SKOV3细胞增殖。表2的研究结果表明，顺铂联合小檗碱处理SKOV3细胞的IC50明显低于单用顺铂(P<0.05)，表明小檗碱与顺铂具有协同抗癌作用。小檗碱是一种廉价、低毒性的抗癌药物，如果在临床卵巢癌的常规顺铂化疗中联合应用小檗碱，可增强对癌细胞的杀伤作用。另外联合应用小檗碱可减少顺铂的使用剂量，可能会降低顺铂的毒副作用。这当然也需要在卵巢癌患者中做更多的研究加以证实。

细胞凋亡是癌症治疗中的一种理想的细胞死亡方式，因为它一般不引起炎症反应。很多抗癌药物均可诱导癌细胞的凋亡。本研究通过流式细胞仪Annexin V/PI法和透射电子显微镜观测结果表明，小檗碱可显著诱导SKOV3细胞凋亡。有研究表明，Bcl-2、Survivin基因对多种肿瘤都有明确的抗凋亡作用[8，9]，Bax是重要的促细胞凋亡基因。本研究通过实时荧光定量RT-PCR检测表明，小檗碱可明显降低Bcl-2、Survivin的表达，增加促凋亡基因Bax的表达，且呈现出剂量依赖性。该结果表明，小檗碱诱导的细胞凋亡可能是通过减少重要的抗凋亡基因Bcl-2、Survivin的表达和增强促凋亡基因Bax的表达而实现。这也需要进一步的研究来证实。

有研究报道，小檗碱可以通过调节miR-21/PDCD4轴而下调miR-21的表达和增强PDCD4(重要的卵巢癌抑癌基因)的表达来提高顺铂的敏感性[10，11]。在本研究中，小檗碱能剂量依赖性地诱导在hMLH1启动子CpG岛的去甲基化，并呈剂量依赖性上调SKOV3细胞中hMLH1基因mRNA的表达。该结果表明，小檗碱可恢复hMLH1启动子的功能，此结果预示小檗碱在癌症预防和治疗中可能具有潜在价值，这需要更多的研究来证实。

总之，天然中药的提取物小檗碱可用作卵巢癌患者的抗癌药物。小檗碱的抗癌作用可能是通过促进癌细胞凋亡和hMLH1启动子的功能恢复起作用，这也需要进一步的研究加以证实。

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[收稿2016-09-19 修回2016-11-08]

(编辑 倪 鹏)

ResearchofberberinetoproliferationandapoptoticmechanismofhumanovariancancercelllineSKOV3

WANGWan,ZHANGFan,YUANHui,YANGWen-Jing.
ObstetricsandGynecologyDepartment,AffiliatedHospitalofJianghanUniversity(TheSixthHospitalofWuhan),Wuhan430015,China

Objective:To investigate the effect of berberine on the proliferation and apoptosis of human ovarian cancer cell(SKOV3).MethodsCell proliferation was detected by MTT method.The cell apoptosis was detected by FCM Annexin V/PI double staining and transmission electron microscopy.The methylation status of hMLH1 gene promoter CpG island was analyzed by methylation specific PCR.The expression of Bcl-2, Bax, Survivin and hMLH1 gene mRNA were detected by real- time fluorescent quantitative RT-PCR.ResultsThe berberine could significantly inhibit the proliferation of ovarian cancer SKOV3 cells(P<0.05) in dose- and time-dependent manner.When combined with cisplatin, berberine showed synergistic anticancer effects.Berberine could induce SKOV3 cells apoptosis significantly, it might lower the expression of Bcl-2 and Survivin gene and enhance the expression of Bax gene.In addition, berberine could restore the hMLH1 promoter methylation status and increase the expression of hMLH1 mRNA.ConclusionBerberine can inhibit the proliferation of ovarian cancer cells and induce apoptosis, which show that the synergistic enhancement anticancer effects with cisplatin.

Berberine；Methylation；Mismatch repair gene；Ovarian cancer SKOV3 cells

R737.31

A

1000-484X(2017)10-1498-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.012

①通讯作者，江汉大学医学院临床医学系，武汉 430056，E-mail：Yuanhui06@126.com。

王 婉(1965年-)，女，主治医师，主要从事妇产科相关方面研究，E-mail：wangwan335@163.com。