抗主要组织相容性相关蛋白MICA/B的单克隆抗体制备及应用①

田 芳 罗伟光 郭旭丽 郭 靖 罗奇志 王慧鹏 邹义洲

(中南大学基础医学院医学免疫学系，长沙 410008)

·免疫学技术与方法·

抗主要组织相容性相关蛋白MICA/B的单克隆抗体制备及应用①

田 芳 罗伟光 郭旭丽 郭 靖 罗奇志 王慧鹏 邹义洲

(中南大学基础医学院医学免疫学系，长沙 410008)

目的制备抗主要组织相容性相关蛋白A/B(MICA/B)的单克隆抗体并对其特异性进行验证。方法以重组MICA*012蛋白免疫小鼠后将其脾细胞与SP2/0细胞进行融合和筛选得杂交瘤细胞株，并用ELISA对其中9B10细胞株产生的单克隆抗体进行效价检测以及通过Western blot、Luminex、免疫荧光对其特异性进行检测。结果获得6株杂交瘤细胞株，其中9B10细胞株产生单克隆抗体(mAb)9B10的最低反应浓度为0.02 ng/μl,且mAb 9B10可应用于Western blot、Luminex和免疫组化荧光试验对MICA和MICB分子的检测。结论成功获得可同时检测MICA和MICB表达的单克隆抗体9B10。

MICA ；MICB；单克隆抗体；杂交瘤细胞

主要组织相容性相关蛋白A和B[Major histocompatibility complex(MHC)class Ⅰrelated chain A and B，MICA/B]是定位于人类第6号染色体短臂上的主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类相关基因A 和B编码的多态性细胞跨膜糖蛋白分子，主要由三个胞外区(α1，α2，α3)、一个跨膜区(TM)和一个胞质尾区构成[1，2]。MICA/B蛋白主要表达在上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞以及肿瘤细胞等细胞膜上[3-5]。 而部分细胞膜表面的MICA可在蛋白酶的作用下水解片段释放于细胞外液形成可溶性MICA(sMICA)，此外MICA还可呈颗粒型分泌到胞外[6，7]。这三种不同形式的MICA分子都没有抗原提呈作用，膜型MICA蛋白地与NK细胞上NKG2D受体结合后为效应细胞的活化提供活化信号，在抗感染、抗肿瘤、移植排斥及自身免疫等方面发挥效应[8]；可溶性MICA(sMICA)竞争性与NK细胞活化性受体NKG2D结合阻碍NK细胞的免疫监视作用，是肿瘤逃逸机制之一[9]；颗粒型MICA不仅可下调细胞表面NKG2D的表达，而且能降低NK 细胞的杀伤效应[10]。目前国内外研究已证实MICA蛋白的表达水平与肿瘤、自身免疫性疾病、移植排斥等多种炎性疾病相关[11-13]。显然，以MICA为靶点的研究已成为免疫学、肿瘤学等研究领域的热点。在科研和已临床检测中都需要用到MICA抗体，目前虽然已有商业化的MICA抗体可用于ELISA、Western blot等实验，但在实践中，我们发现已有的商业化抗体效价偏低且应用范围窄。因此，我们在制备了12种MICA和4种MICB多态性重组蛋白的基础上，应用杂交瘤技术制备高效价的抗MICA和MICB的单克隆抗体，为研究MICA/B分子的生物学功能及其在免疫学中的应用提供更好的工具。

1 材料与方法

1.1材料 4周雌性BALB/c小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司；小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0、rMICA和rMICB、mAb 6B3均为中南大学基础医学院免疫学系保存；胎牛血清(FBS)、羊血清、次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶脱氧核苷酸(HAT)培养基、HT培基、聚乙二醇、完全弗氏佐剂均购自Sigma公司；RPMI1640培养基购自GE公司；PE、FITC、HRP标记的羊抗鼠IgG购自BioRad公司；mAb AMO1(anti-MICA)购自BAM公司；mAb MAB1599(anti-MICB)购自RD公司；PNGase F试剂盒购自Biolabs公司；Protien A/G购自Invitrogen公司;蛋白浓度测定试剂盒购自Pierce公司等。

1.2方法

1.2.1杂交瘤细胞的制备

1.2.1.1动物免疫 50 μg纯化的rMICA*012重组蛋白与等体积的完全弗氏佐剂混合乳化后皮下多点注射到雌性BALB/c小鼠。此后第15、21、28天，依次将50 μg rMICA*012蛋白与等体积的完全弗氏佐剂混合乳化后皮下注入小鼠体内以加强免疫。第2次加强免疫1周后，从小鼠尾部取少量静脉血，通过间接ELISA检测血清效价。效价检测合格后，在第3次免疫后的一周或细胞融合前3天，腹腔内注射PBS稀释的50 μg rMICA*012重组蛋白。无菌分离收集小鼠脾脏B淋巴细胞。

1.2.1.2细胞融合 将增殖期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与新鲜分离的免疫小鼠的B淋巴细胞按5:1的比例混匀，离心弃上清后加入50%聚乙二醇进行细胞融合，然后慢慢加入RPMI1640培养基终止反应，离心弃上清，用HAT培养基重悬细胞，铺于96孔细胞培养板，置37℃、5%CO2培养箱中培养。7～10 d后换用HT培养基继续培养。

1.2.1.3阳性克隆筛选和培养 我们采用ELISA法对细胞培养上清进行筛选。聚苯乙烯板分别用100 μl 500 ng/ml rMICA*012包被4℃过夜。次日所有孔用0.05% Tween20-PBS洗涤3次。再用5%脱脂奶粉-PBS 37℃封闭2 h，如上述洗涤3次。然后37℃孵育100 μl样本2 h。同上洗涤3次后加入标志HPR的羊抗鼠IgG的抗体(1∶5 000稀释)，37℃孵育1 h。洗涤3次再加入TMB显色液100 μl/孔，显色15 min后加入50 μl 2 mol/L硫酸终止反应，最后在450 nm处读取吸光值。将阳性孔杂交瘤细胞进行有限稀释克隆化培养，直至培养孔仅出现单一细胞克隆并筛选其上清呈阳性反应。

1.2.1.4单克隆抗体收集与纯化 对筛选出的稳定杂交瘤细胞9B10细胞采用RPMI1640完全培基扩大培养，收集培养液-80℃存储备用。待收集一定量的9B10细胞培养上清后进行离心去沉渣保留上清按说明书要求用Protien A/G进行单抗的纯化，纯化的抗体用蛋白浓缩管(10 kD)、Tis-HCl pH7.4和PBS对单抗进行浓缩和缓冲液的置换。

1.2.2杂交瘤细胞的鉴定

1.2.2.1抗体效价及浓度测定 采用间接ELISA法对杂交瘤细胞的培养上清mAb效价进行检测，方法同阳性筛选。用蛋白浓度测定试剂盒对浓缩后的mAb浓度进行检测，标记，-80℃保存。

1.2.2.2Western blot 法检测mAb的特异性 取40 ng rMICA和rMICB经10%SDS-PAGE后湿转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉-PBS液37℃封闭1 h。洗涤后加入1∶100稀释的9B10细胞上清，4℃过夜。0.1%Tween20-PBS洗膜3次，每次10 min，加入1∶5 000倍稀释的羊抗鼠HRP-IgG，37℃孵育2 h，PBST洗膜3次，每次15 min，加入化学发光显色液，立即用化学发光检测系统采集图像。按照说明书将1 μg的rMICA和rMICB进行去糖基化处理，按照上述进行Western blot检测。HeLa、HCT116、L02细胞采用细胞裂解液(150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tis-HCl pH8.0，1%NP-40，1×蛋白抑制剂)冰上裂解30 min，4℃离心15 min后取上清并测浓度，取20 μg总蛋白按说明书进行去糖基化处理。40 μg的未去糖基化蛋白和20 μg去糖基化蛋白同上进行Western blot检测。

1.2.2.3Luminex检测抗体 向Luminex专用板每孔加入25 μl PBS(含10%羊血清)；每个对应孔中加入15 μl检测抗体(9B10、AMO1、MAB1599、W6/32，浓度均为饱和浓度5 μg/ml)。室温微摇孵育20 min，离心后对应孔加入20 μl MICA和MICB微球，混匀后室温孵育45 min，离心后采用0.05%tween20/PBS洗涤3次，每孔加入60 μl 1%PE-羊抗鼠IgG(PBS稀释，含10%羊血清)混匀室温孵育30 min，离心洗涤3次，最后每孔加入60 μl PBS，混匀后上机检测(Luminex 2000)，计算平均荧光强度。

1.2.2.4免疫荧光 在24孔板中所用的孔中各放1片无菌专用爬片，以1×105个/孔分别接种HeLa、HCT116、L02细胞，待细胞贴壁生长至20%左右取出玻璃爬片，用预冷的洗涤液(含2%FBS和0.1%叠氮化钠的PBS)洗涤3次后加入200 μl预冷的4%多聚甲醛室温固定15 min；洗涤3次后用10%羊血清37℃封闭1 h；4℃孵育一抗过夜(W6/32、9B10、mouse-IgG)；次日洗涤后加入HRP-羊抗鼠的IgG 37℃孵育1 h，洗涤3次后加入抗荧光淬灭封片剂封片，尽快进行荧光显微镜检。

1.2.2.5流式细胞 将HeLa、HCT116、L02细胞用2.5%的胰酶消化后收集至1.5 ml EP管中，并采用洗涤液(含2%FBS和0.1%叠氮化钠的PBS)离心洗涤3次后，2%FBS-PBS重悬细胞并计数。每种细胞各以1×106个细胞分装至4个EP管中，标记。每个对应管中加入200 μl对应的一抗(9B10、6B3、W6/32，浓度均为500 ng/ml)，4℃孵育30 min后用洗涤液洗涤3次，再向各孔加入200 μl FITC-羊抗鼠IgG(用2%FBS-PBS按1∶200稀释后使用)。4℃孵育30 min，采用洗涤液洗涤3次后各孔加入400 μl 2%FBS-PBS并吹打均匀，上机检测荧光强度。

2 结果

2.1杂交瘤细胞的制备与克隆筛选 经过3次免疫BABL/c小鼠进行皮下多点注射rMICA*012和腹腔注射高表达MICA*001和MICA*002的转基因淋巴细胞HMY，并用以MICA和MICB重组蛋白作为抗原的间接ELISA方法检测血清抗体效价，获得两只符合用于制备杂交瘤细胞的免疫小鼠，脱臼处死并取其脾细胞在50%聚乙二醇中与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，克隆细胞于10块96孔细胞培养板第一次阳性克隆筛选从960孔的细胞培养上清中筛选出38孔含有抗rMICA*012阳性的细胞克隆，然后立即对这38株杂交瘤细胞进行亚克隆筛选，为了验证这些细胞株可否与多种MICA和MICB等位基因重组抗原反应。我们采用r-MICA*001、r-MICA*002、r-MICA*004、r-MICA*006、r-MICA*007、r-MICA*008、r-MICA*009、r-MICA*012、r-MICA*017、r-MICA*018、r-MICA*019、r-MICA*045、r-MICB*002、r-MICB*004、r-MICB*005、r-MICB*008标记的Luminex单抗原悬液芯片进行检测筛选出6株抗MICA、抗MICB和同时抗MICA和抗MICB的单克隆细胞株，置液氮中保存备用。本文仅以具有抗MICA和抗MICB特异性的杂交瘤细胞株(9B10)作为研究对象，对其特性进行鉴定。

2.2抗MIC单克隆抗体的鉴定

2.2.1单克隆抗体的纯化和效价检测 收集9B10细胞培养上清用Protien A/G层析柱纯化和提取抗MIC的单克隆抗体IgG，再经蛋白浓缩管浓缩获得浓度为5.5 mg/ml的mAb 9B10。采用0.1%考马斯亮蓝染液对其SDS/PAGE电泳凝胶进行染色，结果显示在55 kD和25 kD的分子量大小的位置检出IgG重链和轻链的蛋白条带，无其他杂带(见图1A)。用羊抗鼠重链分子的抗体类型鉴定试剂盒(ELISA)确定mAb 9B10为IgG1亚类。采用500 ng/ml的r-MICA*012重组蛋白包被ELISA酶标板对9B10单克隆抗体倍比稀释后的抗体效价进行测定，结果显示mAb 9B10稀释至0.02 ng/μl时仍然呈阳性反应，其饱和反应浓度≥1.25 ng/ μl(见图1B)。以相同蛋白稀释浓度的小牛血清白蛋白(BSA)为阴性对照。

2.2.2mAb 9B10单克隆抗体特异性的鉴定 通过Western blot法检测9B10单抗与多种rMICA和rMICB重组蛋白进行反应，并用去糖基化酶去除重组蛋白上糖基残基后再次测定。结果显示不管是否去糖基化，9B10均能显示出MICA和MICB蛋白条带(见图2A)，而重组的MICA和MICB的胞外结构域片段经去糖基化处理后分子量由45 kD左右下降到38 kD，说明9B10抗体可应用于对MICA和MICB变性处理后蛋白的检测，且具备与MICA和MICB共同反应的特性。

用Western blot检测9B10抗体的反应性，说明该抗体可识别MICA和MICB蛋白变性后的抗原表位。将可溶性的MICA和MICB重组蛋白标记多种Luminex beads制成悬液芯片，模拟抗原的天然结构状态，然后对mAb 9B10的反应性进行分析。通过检测9B10分别与单个MICA/B 抗原微反应后的平均荧光强度(MFI)，确定抗体的亲和力。mAb 9B10、mAb AM01(Anti-MICA)、mAb MAB1599(Anti-MICB)、mAb W6/32(Anti-HLA-Ⅰ)均对单抗原微珠进行反应测定。结果显示9B10具有同时与MICA和MICB共同反应的特性。而对照组中，AMO1单抗仅对11种多态性MICA抗原有反应(与r-MICA*001、002、004、006、007、008、009、019、045具有较强的亲和力，与r-MICA*017、018只具有较弱的亲和力)，而与MICA*012不反应。MAB1599单抗仅对4种MICB多态性抗原有反应，而W6/32对MICA和MICB抗原均无反应(图2B)。

图1 9B10抗体纯化和滴度检测Fig.1 Purification and detection of mAb 9B10Note:A.Purified mAb 9B10 IgG was showed in SDS/PAGE gel with coomassie brilliant blue staining.M.Marker;9B10,mAb 9B10;W6/32.mAb anti-HLA was used,as positive control.B.OD450 value was read by ELISA with antigen of rMICA*012 against a series dilution of mAb 9B10.

图2 mAb 9B10与重组蛋白rMICA和rMICB反应的结果Fig.2 Reaction of mAb 9B10 against recombinants of rMICA and rMICBNote:A.Recombinant proteins rMICA and rMICB,with PNGase F treated(+)or without treated(-)were tested with mAb 9B10 in SDS/PAGE by Western blot.The glycosylated rMICA and rMICB were detected with apparent molecular weight of 45 kD,after deglycosylation,they were reduced to 38 kD；B.The affinity of mAb 9B10 reacted to rMICA and rMICB with Luminex single antigen mutiplex microsphere-based flow cytometry.Monoclonal antibody AM01(Anti-MICA)，MAB1599(Anti-MICB)and W6/32(Anti-HLAⅠ)were used as control.MFI,the mean fluorescence intensity was used as the index of the amount of mAb 9B10 binding.

2.3应用9B10单抗检测肿瘤细胞株上MICA和MICB的表达 确定9B10单抗具有与MICA和MICB抗原反应的特性后，用9B10单抗对人细胞株进行MICA和MICB的检测。选择3种细胞株(肿瘤细胞株HeLa、HCT116以及永生化细胞株L02)分别用Western blot、免疫组织化学荧光、流式细胞术进行检测，HeLa细胞和HCT116细胞有MICA/B的表达，而L02细胞为正常的肝脏细胞，没有MICA/B的表达。在免疫印迹反应中，9B10检测变性的MICA/B蛋白质，未经N glycanase处理，反应条带显弥散状；而经去糖基化处理后，反应条带呈纤细状(图3A)。结果表明9B10具有检测肿瘤细胞株上MICA/B变性状态蛋白的能力。

图3 单抗9B10检测肿瘤细胞株上MICA和MICB的结果Fig.3 Detection of MICA and MICB expression in tumor cell lines with mAb 9B10Note:A.Detection of MICA and MICB molecules in the cell lysates with mAb 9B10 by Western blot.HeLa(human cervical cancer cell),HCT116(Human colon cancer cell),and L02(human normal liver cell)were used as test cells；B.Detections of MIC expression on the cell surface with immunofluorescence assay.IgG from normal mice was used as negative contol;W6/32,mAb of anti-HLA,was used as positive control.C.Detection of MIC on the surface of cells by flow cytometry.Normal mice IgG(black lines)was as isotype control;mAb 9B10(blue lines)and mAb 6B3(green lines)were used to detect MICA expression;W6/32(red line),mAb of anti-HLA-I was used as positive control.

另外，我们用9B10对固定在玻片培养的HeLa、HCT116和L02细胞进行免疫组织荧光实验检测细胞膜表面的蛋白质表达情况。结果显示，HeLa和HCT116细胞膜上显现较强的荧光反应，而L02细胞无荧光反应。其结果与Western blot的结果一致(图3B)。说明9B10可以应用于对组织细胞免疫组织化学的染色和MICA/B定位测定。

由于上述两种免疫反应均检测变性的MIC蛋白分子。用细胞流式细胞术对HeLa、HCT116和L02活细胞膜上的自然状态(未变性)的MICA/B蛋白表达进行检测。W6/32显示三种细胞有较高的HLA-Ⅰ类分子的表达。然后9B10单克隆抗体对HeLa和HCT116细胞膜上的MICA/B分子均无反应(图3C)。说明9B10抗体对自然状态的MIC膜蛋白分子反应性明显偏低，不能应用于细胞流式反应。

3 讨论

MIC属于MHC-Ⅰ类基因中参与调节免疫功能相关基因之一，该基因编码的MIC蛋白在结构上与HLA-Ⅰ类分子相似，但其不和β-2微球蛋白结合，功能上不参与抗原提呈。MIC蛋白主要集中表达在肠道上皮中，其他正常组织脾脏、心脏、肝脏等无表达[14]。随着对MIC的深入研究发现MIC蛋白与移植排斥、肿瘤逃逸、自身免疫性疾病等众多疾病相关[1,10,15]。

在本研究中采用杂交瘤技术制备多株杂交瘤细胞，并对9B10细胞株分泌的单克隆抗体进行鉴定。在研究中我们只采用重组蛋白rMICA*012免疫小鼠，但是在筛选和9B10抗体鉴定中发现该抗体具有同时与γMICA和MICB反应的特性，经文献查阅发现Zou等[16]用rMICA*008制备的抗MICA单抗(mABb 6B3)也同时与多个MICA多态性蛋白结合。国内外研究显示MICA和MICB基因编码区间序列同源性大于90%，MICA和MICB蛋白间具有相同或相似的保守区域[17]，同时国内研究者通过抗体吸附和洗脱实验也证实了不同的MICA多态性蛋白间共享抗原表位[18]。因此，利用MICA和MICB蛋白具有相似保守区域的特性成功地制备能同时与MICA和MICB结合的抗体。为了更接近天然蛋白，我们的r-MICA和r-MICB重组蛋白也为重组糖蛋白。而在异源表达系统中蛋白的糖基化存在不均一性，受多种因素影响如细胞类型、培养条件[19]。有学者认为在真核细胞表达系统中N-聚糖为复合型和杂合型，糖基化程度强于原核表达系统[20]。在本研究中用到的多种重组MICA和MICB也为糖基化蛋白，rMICA*001、004、006、007、008、009、012、017、018、019均在原核表达系统中表达[16,21]，而rMICA045、MICB004为本实验采用真核表达系统构建表达纯化的蛋白。因此在免疫印迹检测9B10抗体与不同MICA和MICB反应时，未去糖基化的MICA/B分子量大小不一，rMICA*045和rMICB*004分子量高于其他蛋白，但是一旦去糖基化，分子量大小相近。

通过Western blot和Luminex实验显示9B10单克隆抗体具有能同时与MICA和MICB结合的特性，于是我们进一步扩大该抗体在其他实验中的应用，研究指出9B10抗体还可应用于免疫组织化学检测，但不可用于流式细胞术检测。这也预示着9B10单克隆抗体有可能只与变性的以及半变性的MIC蛋白抗原反应，而不与天然的MIC蛋白抗原结合。mAb 9B10在免疫组化中的应用将为我们临床检测MIC蛋白提供重要的检测手段，我们可以采用组织化学染色直观地显示MIC蛋白分子的检测，同时还可以对MIC蛋白表达进行定位检测。

总之，相对于昂贵的商品化试剂，9B10单克隆抗体具有高效价、易获取的特点。同时，9B10单克隆抗体可同时运用于Western blot、Luminex、免疫荧光等实验中，有助于我们在科研和临床上对MIC蛋白抗原的检测和研究。

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[收稿2017-05-05 修回2017-06-03]

(编辑 许四平 刘格格)

Productionandapplicationofmonoclonalantibodyagainstmajorhistocompati-bilitycomplexclassⅠrelatedchainAandB

TIANFang,LUOWei-Guang,GUOXu-Li,GUOJing,LUOQi-Zhi,WANGHui-Peng,ZOUYi-Zhou.
DepartmentofMedicalImmunology,SchoolofBasicMedicalScience,CentralSouthUniversity,Changsha410008,China

Objective:Generation and identification of hybridoma to produce monoclonal antibody against MICA/B.MethodsSP2/0 cells were fused with murine splenocyte immunized with recombinant protein rMICA*012 to get hybridoma cell lines.The titer of the monoclonal antibody produced by 9B10 cell line was determined by ELISA and its specificity was tested by Western blot,Luminex mutiplex microsphere-based immunoassay and immunofluorescence assay.ResultsSix hybridoma cell lines were selected by ELISA screening test.The minimum reaction concentration of mAb 9B10 was 0.02 ng/μl,and the specificity of mAb 9B10 was determinated by Western blot,Luminex mutiplex microsphere-based immunoassay and immunofluorescence.ConclusionThe monoclonal antibody 9B10 was available to apply for the detection of MICA and MICB expression.

MICA ;MICB;Monoclonal antibody;Hybridoma cells

①本文受国家自然科学基金面上项目(81273265，81571562)和湖南省自然科学基金重点项目(2013FJ2005)资助。

R392.4

A

1000-484X(2017)10-1514-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.015

田 芳(1991年-)，女，在读硕士，主要从事免疫学的研究。

及指导教师：邹义洲(1963年-) ，男，博士，教授，博士生导师，主要从事移植免疫学和免疫遗传学研究，E-mail:zouyizhou@hotmail.com。