子莲品种抗镰刀菌腐败病的室内鉴定方法

魏林，梁志怀，成燕清

（1.湖南省农业科学院植物保护研究所，长沙，410125；2.湖南省农业生物技术研究中心）

子莲品种抗镰刀菌腐败病的室内鉴定方法

魏林1，梁志怀2，成燕清1

（1.湖南省农业科学院植物保护研究所，长沙，410125；2.湖南省农业生物技术研究中心）

应用莲籽萌发的实生苗浸根接种镰刀菌腐败病病原，根据接种实生苗叶片表现出的腐败病症状分级标准，对病害等级进行鉴定，进而确定子莲品种对腐败病菌的抗病能力。该方法实现了室内快速、准确鉴定不同子莲品种对镰刀菌腐败病的抗性。

莲籽；镰刀菌腐败病；快速鉴定；抗性

1 材料与方法

1.1 试验材料

①供试病原菌 从腐败病病组织分离经过单胞分离纯化后，再通过形态学、柯赫氏法则验证、分子鉴定确定的莲真菌性腐败病病原菌——尖孢镰刀菌莲专化型。

②供试子莲 选择颗粒饱满、充分成熟的当年莲籽作为供试材料。

③感病对照和抗病对照的选择 选择当地主栽的、历年腐败病发生较为严重的品种，作为感病对照；选择当地主栽的、历年腐败病发生较轻的品种，作为抗病对照。

1.2 试验方法

①子莲腐败病病原菌强致病性菌株的筛选供试腐败病镰刀菌病原菌用PDA培养基培养5 d后，用无菌打孔器自菌落边缘取7 mm的菌饼，纵剖切取大小一致的新鲜藕块，将菌饼置于藕块的中央位置，菌丝体面朝下，每个藕块等距离接种2个镰刀菌菌饼，然后将装有已接种藕块的发芽盒置于26℃恒温培养箱中保湿培养5～7 d。按下述分级标准调查藕块发病情况：0级，藕块生长正常、完好；1级，藕块表面有轻微病变，病变尚未侵及藕块体内组织；2级，藕块组织有明显病变，维管束呈褐色；3级，藕块维管束呈深褐色，病变部分占藕块总面积的 10%以下；4级，藕块维管束呈深褐色，病变部分占藕块总面积的 10%～30%；5级，藕块维管束呈深褐色，病变部分占藕块总面积的30%以上。每个藕块为一计量单位，每种病原菌接种20个藕块。病情指数=∑（各级藕块数×相对级数值）/(调查总藕块数×5）×100；其致病力强弱的划分标准：病情指数>70，表示强致病力；30<病情指数≤70，表示中致病力；病情指数≤30，表示弱致病力；病情指数为0，表示无致病力。选取强致病性菌株作为子莲品种抗病鉴定的接种菌株。

②接种体的繁育 将保存于PDA斜面培养基中的腐败病菌株移植于PDA平板培养基上，在25℃条件下培养，待菌株菌丝长满培养皿后，在无菌条件下，接种于盛有PD培养液的三角瓶中（液体培养基的量以占三角瓶容量的30%～35%为宜），25℃下120 r/min振荡培养7 d，培养液经2层灭菌纱布过滤，再经4 000 r/min离心10 min，倒掉上清液后，加入灭菌蒸馏水调制成分生孢子浓度为1×105个/mL的接种体悬浮液。

③鉴定材料的培育 将当年生的莲籽，用尖嘴钢钳把含莲籽种脐一端破一小口后，完全浸没于无菌水中。待种子发芽后，将发芽莲籽移植适宜水培的容器，倒入刚好浸没莲籽的适量灭菌水，于25℃条件下培育。

④鉴定材料的接种及接种后的管理 当发芽的莲籽长至具3～5条根的实生苗（此时一般有3～5片叶）时，用灭菌的剪刀将每条根在距根尖0.5 cm处剪断，以造成根系的微伤口，然后将整个根系浸入由无菌水调节的含1×105个孢子/mL接种体悬浮液中30 min，以浸泡等体积无菌水的实生苗为对照。将接种后的实生苗移栽至盆钵中栽培，栽培土为灭菌的砂壤土。每个材料重复3次，每重复20株苗。接种室的温度保持在24～26℃，栽种钵内始终保持有1～2 cm的水层。

1.3 鉴定材料病情调查

表1 子莲抗腐败病室内鉴定病情级别的划分

表2 子莲品种对腐败病抗性的评价标准

②调查时间 接种后15～20 d调查，并根据此期间感病的对照品种病级扩展到感病病级的时间作适当的调整。

③调查方法和病情指数的计算 调查每一株苗所有展开的叶片，根据表1中症状描述调查、记载每份材料叶片的病情级别，并按式①计算病情指数DI。

DI=[∑（di×li）]/（L×6）×100 式①

式①中，di表示各病情级别的代表数值；li表示各病情级别对应的叶片数；L表示调查总叶片数。

表3 不同子莲品种不同接种时期发病情况

1.4 鉴定材料抗病性评价

①抗病性评价标准 依据被鉴定材料3次重复的病情指数（DI）平均值，按表2划分标准确定其抗性水平。

②鉴定有效性判别 当感病对照材料达到相应感病程度（DI＞60），抗病对照材料与实际抗性程度相符时，该批次鉴定视为有效。

2 实施实例

在湖南省湘潭地区白石镇、石鼓镇、乌石镇子莲主种植区，选取对莲腐败病表现不同抗性的本地子莲品种，无具体名称，本研究将其分别命名为湘莲1，2，3，4号。其中湘莲1号在主栽地表现为感病品种，田间最高发病率可达75%以上；湘莲2号和3号在主栽地表现为中抗品种，田间发病率一般为25%～40%；湘莲4号在主栽地表现为高抗品种，田间最高发病率一般为5%～8%。按本文所述方法对上述4个品种进行了腐败病抗性的室内鉴定，鉴定结果见表3。

3 小结

应用本方法多次试验结果表明，接种10 d，田间抗性表现不同的品种，在盆栽试验发病率上已显示出抗性的区别，但病情指数尚未有显著的差异；随着病情发展，接种20 d时，不同抗性品种间的发病率和病情指数呈现显著差异，但接种20～25 d时，不同抗性品种间的发病率差异又逐渐趋于不显著，而通过病情指数所确定的各品种的抗性能力已很稳定，20 d、25 d与30 d抗性评价结果均完全一致，说明应用病情指数鉴定品种对腐败病的抗病性较应用发病率鉴定更为准确和科学，在接种后20～25 d通过比较病情指数，能完全区分出子莲不同品种间对腐败病抗性的差异。多次不同品种鉴定试验结果显示，对腐败病室内抗性鉴定结果与田间抗病表现完全吻合，证明应用该鉴定方法能够快速、准确地鉴定出不同子莲品种对镰刀菌腐败病的抗性能力，可为大量筛选子莲腐败病抗病品种提供一个可靠依据。

Laboratory Method on Identifying Resistance to Fusarium Rot for Seed Lotus Cultivars

WEILin1,LIANG Zhihuai2,CHENG Yanqing1
(1.Institute of Plant Protection,Hunan Academy ofAgricultural Sciences,Changsha 410125;2.Hunan Agricultural Biotechnology Research Center)

The roots of germination seedlings from lotus seeds were dipped to inoculate pathogens of Fusarium rot.According to the classification standard of rot symptoms to the seedling blade,the levels of disease were identified.And then,the resistance of seed lotus cultivars to Fusarium rotwas determined.The method realizes the resistance evaluation of seed lotus root cultivars to Fusarium rot rapidly and exactly in laboratory.

Lotus seed;Fusarium rot;Rapid identification;Resistance

S645.1；S436.45

A

1001-3547（2017）18-0154-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.18.048

子莲属睡莲科植物，是中国莲三大品系（藕莲、子莲、花莲）栽培品种之一，因其具有观赏价值高的莲花、味美可口的鲜食嫩籽、可加工成各种营养丰富食品的老熟莲籽，在我国具有十分悠久的种植历史。近年来，随着种植业结构调整，我国的子莲种植面积有了较大幅度增加，已成为莲农创收的重要途径。

子莲从浮叶生出到莲蓬采收的整个生育期，都会受到腐败病的为害，该病可使子莲地下茎腐烂坏死，地上部枯萎，一般造成子莲减产20%～45%，严重时达60%以上，甚至绝收，严重影响了莲籽的品质和产量。莲腐败病主要是由镰刀菌属真菌侵染引起的一种土传病害，该病首先为害子莲的地下茎（藕节），地下部受到病原菌的侵染出现病变后，病茎生出的地上部叶片和叶柄才逐渐显症。由于莲镰刀菌腐败病发生时种植环境的特殊性、地上部显症明显的滞后性以及荷叶特殊的纳米结构使得药液难附着性，都增加了该病的防治难度，使得常规的防治措施很难取得较好的防控效果。因此，选育和种植抗病品种是防治该病经济有效的方法之一，其中建立便利高效的子莲抗腐败病的鉴定评价体系和方法，是开展该项工作的基础。本研究应用莲籽实生苗，通过人工接种腐败病菌，并根据实生苗叶片发病特点制定了相应的发病程度分级标准及品种抗性等级，获得了一套子莲抗腐败病室内鉴定技术，实现了不同子莲品种对镰刀菌腐败病抗性的室内快速、准确鉴定。现将该方法介绍如下。

湖南省蔬菜产业技术体系项目；湖南省技术创新引导计划项目（2016NK3015）

魏林（1970-），女，博士，研究员，主要从事水生蔬菜病害综合防治研究，电话：0731-84693299，E-mail：nkyweilin@163.com

2017-07-10