商陆PaHAK1与拟南芥HAK/KUP/KT家族基因的比较分析

谭鹏，邓雯韬，田宇，苏益，蔺万煌*



商陆与拟南芥//家族基因的比较分析

谭鹏1,2，邓雯韬1,2，田宇1,2，苏益1,2，蔺万煌1,2*

(1.湖南农业大学植物激素与生长发育湖南省重点实验室，湖南长沙 410128；2.南方粮油作物协同创新中心，湖南长沙 410128)

为探明商陆高亲和性K+转运体基因()的结构、功能及商陆耐低钾的原因，分析比较了商陆和拟南芥家族基因中15个基因编码的高亲和性钾离子转运体氨基酸序列、蛋白质结构及其理化性质。结果表明：基因家族编码蛋白均定位于细胞膜上，含有多个跨膜结构且跨膜结构域是蛋白质的保守结构域；PaHAK1与AtKUP3的跨膜结构十分相似，低钾胁迫下和的高表达与其高亲和钾转运吸收功能密切相关。系统进化树分析结果表明，PaHAK1与拟南芥基因家族中AtKUP8亲缘关系最近，其氨基酸序列相似度为76.98%，推测还可能通过维持细胞内高水平钾量在水分胁迫下发挥重要的调节作用。

商陆；拟南芥；；；高亲和性钾离子转运体；生物信息学分析

钾离子对植物的生长发育及维持细胞渗透压有重要作用。中国土壤和作物中的钾素含量普遍偏低[1–2]。利用已获得的K+吸收转运相关基因，可以改善作物的钾素营养性状，提高对环境中钾素的利用率[3]。严蔚东等[4]在利用异源基因资源改良作物钾素营养特性领域进行了探索，其将和导入水稻，获得的转基因植株在低钾和高钾条件下的钾累积能力都有所提高。GUPTA等[5]从水稻中克隆到27个钾转运体家族基因，为通过基因工程的方法提高作物中这些基因的表达水平和改良钾营养性状打下了基础。商陆(Roxb)吸收和富集钾的能力非常突出，特定环境中其含钾量最高可达到植株干物质质量的10%以上，又能在K+浓度极低(微摩尔水平)的土壤中正常生长发育[6]。为深入探讨商陆基因功能，本研究中将获得的商陆基因与拟南芥家族基因进行比较分析，旨在揭示商陆钾素高效吸收转运的分子机制，利用商陆高亲和性K+吸收转运基因进行作物钾素营养性状遗传改良，现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1　商陆HAK1及拟南芥HAK/KUP/KT基因家族基因的获得

商陆基因由湖南农业大学植物激素与生长发育湖南省重点实验室克隆并提供相关信息[7]。拟南芥基因家族的mRNA序列以及编码的蛋白质序列从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm. nih.gov/)获得。

1.2　拟南芥HAK/KUP/KT基因家族染色体定位及基因结构分析

从NCBI中获取染色体定位信息，利用MapDraw V 2.1进行染色体定位作图。

1.3　商陆HAK1及拟南芥HAK/KUP/KT基因家族基因蛋白质序列生物信息学分析

采用在线工具Protparam(http://web.expasy.org/ protparam/)对商陆及拟南芥基因编码蛋白的理化性质进行分析预测，预测蛋白质的氨基酸序列、数量、等电点、分子量[8]。亚细胞定位采用在线软件PSORT(http://www.genscript. com/tools/psort/)进行预测。应用结构域在线分析软件SMART(http://smart.embl.de/)对保守结构域进行验证和功能注释。跨膜结构采用在线软件TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM–2.0/)进行分析。蛋白跨膜结构模型采用PROTTER(http://wlab. ethz.ch/protter/start/)建立[9]。

1.4　商陆HAK1及拟南芥HAK/KUP/KT基因家族基因系统进化树的构建

使用Clustal X 软件对拟南芥中已知的15个基因家族蛋白及商陆基因编码蛋白进行氨基酸序列比对，比对结果通过MEGA6软件生成进化树。进化树的构建采用最大简约法(maximum parsimony，MP)，Bootstrap值设置为1 000[10]。

2　结果与分析

2.1　HAK/KUP/KT家族基因染色体定位及基因结构分析

从表1可以看出，所有基因都包含6个以上的内含子，其长度表现出较大差异，外显子数不同，因此拟南芥基因家族基因的结构存在较大差异。对已获取的基因信息利用MapDraw V 2.1进行染色体定位作图，结果(图1)表明，基因家族在拟南芥1~5号染色体上均有分布，其中，4号染色体有6个基因家族基因，2号染色体有4个，1号和5号染色体各有2个，3号染色体上只有1个。

表1　拟南芥HAK钾离子转运体基因的基本信息及结构

图1　拟南芥HAK/KUP/KT基因家族染色体定位

2.2　HAK/KUP/KT基因编码蛋白的理化性质分析

基因编码蛋白的基本理化性质以及亚细胞定位见表2。PSORT预测结果显示，编码一个含有771个氨基酸的蛋白，其分子式为C3980H6199N1003O1092S34，分子量为86 662.11，等电点为7.54，包含带正电残基(Arg + Lys)72个，带负电残基(Asp + Glu)71个。进一步分析得到该蛋白的不稳定系数为38.46，脂肪系数为107.94，说明编码蛋白为稳定蛋白，且在不同环境中稳定性较好；平均亲水性系数为0.269，大于0，说明该蛋白属于疏水蛋白。基因编码蛋白的氨基酸残基数为593~880，最长的KT5含有880个氨基酸残基，最短的KUP1只含有592个氨基酸残基。基因家族大多数蛋白质都属于疏水蛋白，只有KT1、KT2/3和KT5为亲水性蛋白。拟南芥基因家族中有9个蛋白质稳定性好，只有KT2、KT3、KUP3、KUP6、KUP7、KUP10在不同环境中稳定性较差。

表2　HAK/KUP/KT基因编码蛋白的基本理化性质分析

2.3　HAK/KUP/KT基因编码蛋白结构域分析

采用SMART和TMHMM预测基因编码蛋白的保守结构域及跨膜结构域的结果(图2)表明，商陆和拟南芥基因家族成员的蛋白含有多个跨膜结构，除以外，其他的成员都只有跨膜结构。对比保守结构域和跨膜结构域可以看出，商陆以及拟南芥基因家族中的跨膜结构是蛋白保守结构。

保守结构域中蓝色示跨膜结构(transmembrane region)；黄色cNMP示与蛋白质结合的环核苷酸(cyclic nucleotide–monophosphate binding domain)；绿色ANK示锚定蛋白重复序列(ankyrin repeats)；紫色示低复杂性区域(low complexity region)。跨膜结构域中红色示跨膜结构(transmembrane region)；蓝色示细胞内(intracellular)；紫色示细胞外(extracellular)。

2.4 HAK/KUP/KT基因编码蛋白跨膜结构模型

对基因编码蛋白的跨膜结构预测分析结果(图3)显示，不同蛋白跨膜次数有一定差异，但结构类似。16个HAK蛋白跨膜结构可初步分为3种模型：第1种模型，在第2和第3个跨膜区之间拥有一个较长的环状结构(图3–A)，共有11个蛋白具有这种结构；第2种模型，在第1和第2个跨膜区之间拥有一个较长的环状结构(图3–B)，PaHAK1和AtKUP3属于此种模型；第3种模型，没有明显的环状结构(图3–C)，AtKT2/3、AtKUP1属于此种模型。

2.5　HAK/KUP/KT基因编码蛋白系统进化树分析

采用邻接法和最小进化法构建的系统进化树具有一样的拓扑结构，最大简约法构建的系统树也具有类似的拓扑结构，但由于Bootstrap值有的低于70，所以采用了最大似然法(maximum likelihood，ML)构建系统进化树(图4)由图4可知，Bootstrap的值都大于70%，构建的进化树可靠。

进化树分析结果表明，PaHAK1与AtKUP8、AtKUP6亲缘关系最近，其氨基酸序列相似度分别为76.98%、73.15%。从结构域预测发现PaHAK1和AtKUP8蛋白结构也相似。PaHAK1与AtKT1、AtKT2–3、AtKT5亲缘关系比较远，从序列比对结果看相似度均小于15%。

图4 拟南芥及商陆钾离子转运体蛋白的系统进化树

3　结论与讨论

基因家族是H+/K+同向转运载体，主要负责植物根部细胞对K+的高亲和吸收与转运[11–13]，作为最大的K+吸收与转运功能基因家族，基因家族已被证实参与调控植物体多种生理过程。前人的研究结果显示，的关键作用是介导细胞内钾离子的积累[14]。基因除了在植物根中表达外，在植物其他器官中都有特定表达，这表明K+转运体基因不仅在根中介导K+吸收，同时也与植物体内K+的转运、维持细胞内外K+动态平衡相关[15]。在外界环境K+浓度较低时，在介导拟南芥根部吸收与转运K+的过程中发挥着重要的作用。具有双亲和K+转运功能；基因是低亲和K+转运体基因，可以参与调控细胞的伸长和生长[16]；基因在根毛细胞中有特异表达，可以调节拟南芥根部K+的吸收，缺失该基因会使植物根系丧失向下生长的特性[17]。本研究结果表明，PaHAK1氨基酸序列与AtKUP8同源性非常高，KUP6和KUP8参与拟南芥根系钾离子外流、平衡钾稳态，对细胞生长和干旱胁迫反应中的渗透调节起关键作用[18]。由此推测PaHAK1是通过平衡钾稳态对水分胁迫、干旱胁迫发挥渗透调节作用。

本研究结果表明，商陆PaHAK1是一个疏水蛋白，含有11个跨膜结构域，具有钾离子吸收转运体的普遍特征。商陆耐低钾能力强，这与植物在低钾条件下的强吸钾能力密不可分。是高亲和性钾转运体，基因的表达受到钾离子浓度的影响, 随着钾离子浓度升高, 其表达量降低, 缺钾和低钾都能诱导基因在根中高表达[19]。有研究[7]表明，商陆中在根中的表达量受环境中钾离子浓度的影响，环境中钾离子浓度低时能诱导的高表达。另外，在商陆的茎叶中也有少量表达，其在茎叶中的表达量不会因为环境中的钾离子浓度变化而变化，因此推测主要参与商陆根部钾离子的吸收、转运。

本研究结果表明，PaHAK1与AtKUP3的跨膜结构十分相似，在第1个跨膜结构与第2个的跨膜结构之间有一个比较长的非结构域部分，这一部分会形成一个较长的环状结构，这与其他的拟南芥基因家族蛋白结构的第2和第3个跨膜结构之间有环状结构不同。KIM等[20]的研究结果表明，在受到低钾胁迫时，在根中的表达量转录水平显著升高，推测在低钾胁迫下商陆和拟南芥的高表达与其高亲和钾转运吸收功能相关。

植物根系对植物获取环境中的K+起决定性作用。商陆能够在低钾的条件下正常生长发育与钾离子转运体基因相关。在商陆根部能高表达，且具有高效的K+吸收转运机制。在根中的表达量受环境中钾离子浓度的影响，环境中K+浓度低时能诱导的高表达，并介导对K+的高效吸收与转运。

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责任编辑：尹小红

英文编辑：梁和

Comparative analysis ofgene family inandin

TAN Peng1,2, DENG Wentao1,2, TIAN Yu1,2, SU Yi1,2, LIN Wanhuang1,2*

(1.Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China, Changsha 410128, China)

In order to explore the structure and function of the high affinity potassium transporter gene ofRoxb() and analyze the reasons of toleranceto low potassium inRoxb, the amino acid sequences and protein structures and physicochemical properties of 15 high affinity potassium ion transporters ingene family ofandofRoxb were comparedThe results showed that all coding proteins were orientated on cell membrane, and they contained multiple transmembrane domain with conserve amino acid sequences. The transmembrane structure of PaHAK1 was very similar to that of AtKUP3, and the high expression ofandunder low potassium stress was closely related to the high affinity potassium transport and absorption function. Phylogenetic analysis showed that PaHAK1 had the closest evolutionary relationship with AtKUP8 ingene families. Their amino acid sequences similarity was 76.98%. It is suggested thatalso plays an important regulatory role under water stress by maintaining a high level of intracellular potassium.

Roxb;;;; high–affinity K+transporter; bioinformatics analysis

Q943.2

A

1007-1032(2017)05-0490-06

2017–04–10

2017–09–15

湖南省教育厅高校创新平台开放基金资助项目(15K061)

谭鹏(1991—)，女，湖南望城人，硕士研究生，主要从事植物矿质营养学研究，695313374@qq.com；*通信作者，蔺万煌，博士，教授，主要从事植物生长发育与矿质营养学研究，linwhat@163.com

投稿网址：http://xb.hunau.edu.cn