建立荧光定量PCR方法鉴定1例入境人员携带伊科普玛病毒基因

夏冬 宋娟 罗小暖 宋芹芹 王欣玲 武桂珍 韩俊

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒资源中心

·技术方法·

建立荧光定量PCR方法鉴定1例入境人员携带伊科普玛病毒基因

夏冬 宋娟 罗小暖 宋芹芹 王欣玲 武桂珍 韩俊

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒资源中心

目的建立用于检测伊科普玛病毒(Ekpoma virus, EKV)基因的实时荧光定量PCR(qPCR)的检测方法。方法根据GenBank中EKV-1和EKV-2基因的保守序列，设计引物和探针，建立检测EKV-1和EKV-2基因的qPCR方法；使用建立的EKV-1和EKV-2病毒qPCR的检测方法，对1名入境人员携带伊科普玛病毒血清和全血样本的检测。结果建立了检测EKV-1和EKV-2病毒Taqman探针的荧光定量qPCR检测方法，成功检测出1名安哥拉入境人员血清和全血样本中携带EKV-2基因。结论建立的qPCR检测方法可用于血液标本中EKV-1和EKV-2的检测。

伊科普玛病毒属于弹状病毒科蒂布鲁病毒属(Tibrovirus)。弹状病毒科是病毒颗粒形态呈棒状或子弹状的一类病毒，宿主范围广泛，其中已知与人类相关的有狂犬病毒属、水疱病毒属、蒂布鲁病毒属。蒂布鲁病毒属主要包括泰布罗加根病毒(Tibrogargan Virus)、下刚果病毒(Bas-Congo virus)、伊科普玛病毒等[1-3]。

伊科普玛病毒首次报道于2015年3月。当时，美国研究小组在尼日利亚东南部地区进行不明原因急性发热病例调查。通过二代测序技术，在作为对照组的健康人群血液中偶然发现两个不同于已知病原的新基因序列。对这两个全长约12 kb的基因组序列进行测定后，分别命名为EVK-1和EVK-2(2名健康人来自尼日利亚伊科普玛村)。EKV病毒分为2型，分别为EKV-1和EKV-2[4]。

2017年2月，中国疾病预防和控制中心接到1例来自安哥拉的疑似携带伊科普玛病毒基因的男性入境人员(体温正常)报告。2017年3月29日，病毒病所接收到血清和全血样本，通过荧光定量PCR方法再次确认该男子血中携带EKV-2基因。

1 材料与方法

1.1主要仪器与试剂荧光定量PCR仪(德国，Bio-Rad公司)； RNA病毒提取试剂盒(QIAamp Virus RNA Mini Kit，德国，QIAagen公司)；FastSYBR Mixture(CWBIO公司)；One-Step RT-PCR Mix(美国Invitrogen公司)；反转录试剂盒(TaKaRa公司)。

1.2引物和探针的设计与合成通过查阅EKV-1型全基因组(GenBank，KP324827.1)和EKV-2型全基因组(GenBank，KP324828.1)，根据基因保守序列，设计引物和探针，擎科公司合成。

1.3标准品的制备选取EKV-1和EKV-2的保守序列，并合成276 bp和166 bp(由擎科公司和天一辉远公司分别合成)后连接到pUC57-T Vector载体，将该质粒转化大肠埃希菌，提质粒测定浓度定量。定量的标准品分装，-20 ℃保存备用。

1.4检测体系的建立

1.4.1 最适引物浓度的确定： 以上述标准品为模板，采用SYBR Green优化PCR反应体系。反应体系：2×Fast SYBR Green Mix 10 μl，模板2 μl。在Fast SYBR Green反应体系中加入上、下游引物，引物浓度分别为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 μmol/L，用水将体系补充至20 μl，通过Ct值和荧光信号rfu值确定合适的引物浓度。

1.4.2 最适退火温度的确定： 设定45～60 ℃ 8个退火温度，Fast SYBR Green PCR扩增反应程序95 ℃预变性10 min，95 ℃ 30 s、45-60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40个循环，收集荧光信号，检测熔解曲线。

1.4.3 探针浓度的筛选： 以上述标准品为模板对Taqman探针标PCR体系的优化，反应体系：25×One-Step Mix 0.8 μl，2×Buffer 10 μl，模板2 μl。在反应体系中分别加入0.5 μl上、下游引物，加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μl(浓度分别为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 μmol/L)的探针，采用排列组合的方法选择最佳的引物和探针浓度。

1.4.4 标准曲线的建立： 以1×10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度稀释的标准品作为模板，根据上述优化的体系建立PCR检测的标准曲线，依次定量未知模板的浓度。以上述已稀释好的标准品作为模板做PCR，得到标准曲线，进行敏感性确定。

1.5样本检测将送检初筛患者的全血和血清标本分装后，于-80 ℃冰箱冻存。使用Qiagen Virus RNA Mini Kit提取RNA，合成CDNA,取2 μl cDNA，加入PCR体系进行检测。

2 结果

2.1伊科普玛病毒Taqman探针检测方法的建立

2.1.1 EKV-1和 EKV-2病毒荧光定量PCR的引物和探针确定：选取EKV-1和 EKV-2病毒的基因保守区设计多对引物和探针，通过实验比较，最终确定EKV-1的G蛋白基因位于4821-5056bp区域和EKV-2的U1蛋白基因位于2814-2933区域的保守序列为病毒鉴定引物和探针(表1)。

2.1.2 引物、探针浓度和退火温度的确定:将引物浓度通过系列稀释，成对配比，通过SYBR Green方法确定EKV-1、EKV-2引物终浓度为200～250nmol/L。将退火温度从45 ℃至60 ℃设置8个温度梯度进行筛选，确定50 ℃为EKV-1、EKV-2 PCR的最佳退火温度，且获得最适的Ct值和rfu值。将引物浓度和探针浓度进行系列配比，使用One-Step Mix PCR反应体系，确定EKV-1病毒引物浓度为250 nmol/L，探针终浓度为250 nmol/L；EKV-2病毒引物浓度：250 nmol/L，探针浓度250 nmol/L，均获得较好的曲线图。

2.1.3 敏感性确定:通过重叠PCR合成包含4821-5056 bp区域EKV-1的G蛋白基因和包含2814-2933区域的EKV-2的U1蛋白基因，连接T载体，转化大肠埃希菌，提取质粒，测核酸浓度，计算拷贝数。10倍系列稀释质粒，作为模板PCR，得到标准曲线。经计算，EKV-1和EKV-2病毒的实时荧光定量PCR的最低检出限分别为41拷贝/μl，70拷贝/μl。

2.1.4 可重复性: 为了了解EKV-1和EKV-2病毒qPCR的稳定性，将上述两种质粒10倍稀释。每种质粒各稀释3个浓度，每个浓度重复3次，Ct均值分别为15.22、19.10、23.21；16.91、20.64、25.02；标准差分别为0.136、0.031、0.155；0.294、0.295、0.286；经计算变异系数(CV)分别为1.27%、0.20%、0.82%；2.12%、1.74%、1.40%。显示该方法的重复性较好。

表1 EKV-1和EKV-2的引物和探针

2.2伊科普玛病毒核酸检测提取报送入境人员的全血和血清标本的病毒核酸，使用建立的EKV-1和EKV-2 qRT-PCR方法检测。结果显示该份标本EKV-1病毒核酸阴性，EKV-2病毒核酸检测阳性(全血Ct值24.08，血清Ct值34.68)，显示全血中的病毒核酸浓度高于血清，而阴性对照标本为阴性，再次确定该入境人员的血中携带EKV-2病毒核酸。

3 讨论

本研究通过建立的实时荧光定量EKV-1和EKV-2 PCR检测方法，开展中国首例疑似携带伊科普玛病毒的样本(全血样本1份，血清1份)的复核检测。该样本通过高通量测序初步检测出2型伊科普玛病毒基因，经本研究建立的EKV-2 PCR确诊送检样本含有2型伊科普玛病毒基因，而EKV-1 PCR检测方法未检出，说明建立的qPCR检测方法可靠性，具有较好的特异性。本研究发现全血中的病毒核酸拷贝数高于血清，提示该病毒可能在全血细胞中能够较好的复制。

本研究建立了两种型别伊科普玛病毒的实时荧光定量PCR检测方法，阳性标准品反应的灵敏度较高，EKV-1和EKV-2的最低检测下限分别为41拷贝/μl和70拷贝/μl，重复性和稳定性较好。为了更好的评价两种方法，需要采集更多的阳性样本或采用模拟样本(可通过假病毒制备)进行敏感性、特异性评价。

伊科普玛病毒首次报道于2015年3月[4]。当时，美国研究小组在尼日利亚东南部地区进行不明原因急性发热病例调查，通过二代测序技术在作为对照组的健康人群血液中偶然发现两个不同于已知病原的新基因序列，并完成全长约12 kb的基因组序列测定(在尼日利亚的正常人群中发现了伊科普玛病毒)，分别命名为EVK-1和EVK-2(2名健康人来自尼日利亚伊科普玛村)[4]。两个新病毒之间差异较大，结构基因的氨基酸同源性小于40%；病毒进化分析显示，EVK-1与泰布罗加根病毒亲缘关系最近；EKV-2与下刚果病毒亲缘关系最近。该研究小组进一步开展血清学调查发现，尼日利亚东南部地区健康人群普遍感染伊科普玛病毒，EKV-1血清抗体阳性率达10%，EKV-2血清抗体阳性率达50%[4]。研究提示当地人群感染伊科普玛病毒很普遍，但未发现该病毒对人类具有致病性，推测该病毒对人类可能是无症状感染状态。

目前，全球尚未成功分离到伊科普玛病毒。本研究使用BHK细胞、Vero细胞、以及鸡胚接种和乳鼠接种尚未分离出病毒。

[1] Longdon B, Murray GG, Palmer WJ, et al. The evolution, diversity, and host associations of rhabdoviruses[J]. Virus Evol, 2015, 1(1): vev014. doi: 10.1093/ve/vev014.

[2] Ralf G. Dietzgena, Hideki Kondob, Michael M. Goodinc,The family Rhabdoviridae: mono- and bipartite negative-sense RNA viruses with diverse genome organization and common evolutionary origins[J]. Virus Res,2017,227(1):158-170.doi: 10.1016/j.virusres.2016.10.010.

[3] Grard G, Fair JN, Lee D,et al. A Novel Rhabdovirus Associated with Acute Hemorrhagic Fever in Central Africa[J]. PLoS Pathog. 2016, 12(3):e1005503.doi: 10.1371/journal.

[4] Matthew H. Stremlau, Kristian G. Andersen, Onikepe A. Folarin, Discovery of Novel Rhabdoviruses in the Blood of Healthy Individuals from West Africa[J]. PLOS Negl Trop Dis.2015,9(3):e0003631. doi: 10.1371/journal.pntd.0003631.

2017-07-04)

(本文编辑：唐浏英)

Establishmentofareal-timePCRmethodtoidentifyEkpomavirusgeneinbloodsampleofareturneefromAngola

XiaDong,SongJuan,LuoXiaonuan,SongQinqin,WangXinling,WuGuizhen,HanJun

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

HanJun,Email:hanjun_sci@163.com.；SongJuan,Email:helen831020@126.com

ObjectiveTo establish quantitative real-time PCR (qPCR) method based on Taqman probe for detecting Ekpoma virus (EKV).MethodsAccording to the conserved region of gene in EKV genome from GenBank，primers and probe for qPCR were designed. Validity and sensitivity were evaluated in this study. Both whole blood and serum of a returnee from Angola were tested by the established EKV-1 and EKV-2 qPCR method .ResultsSensitivity of EKV-1 and EKV-2 qPCR method was respectively 41 copies/μl and 70 copies/μl. Coefficient of variance (CV) was respectively 1.27%, 0.20%,0.82%；2.12%,1.74%,and 1.40%. EKV-2 gene was detected in both whole blood and serum of a returnee from Angola.ConclusionsThe first EKV-2 gene was confirmed in both whole blood and serum of a returnee from Angola by real-time RT-PCR..

Ekpoma virus; Quantitative real-time polymerase chain reaction

韩俊，Email： hanjun_sci@163.com宋娟，Email：helen831020@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.017

伊科普玛病毒；实时荧光定量PCR

传染病重大专项(2013ZX10004-101, 2012ZX10004401, 2013ZX10004805);卫生行业专项课题(201302006);传染病预防控制国家重点实验室课题(2011SKLID104)

FundprogramsChina Mega-Project for Infectious Disease (2011ZX10004-001, 2012ZX10004401, and 2013ZX10004805), Special Fund for Health-scientific Research in the Public Interest (201302006), SKLID Development Grant (2011SKLID104)