Neuritin与HSP60在大鼠肝损伤组织中的表达及其意义*

吴江文，朱美意，欧阳军，周涛，曹东

（石河子大学医学院第一附属医院 急诊外科，新疆 石河子 832008）

Neuritin与HSP60在大鼠肝损伤组织中的表达及其意义*

吴江文，朱美意，欧阳军，周涛，曹东

（石河子大学医学院第一附属医院 急诊外科，新疆 石河子 832008）

目的研究大鼠肝损伤后不同时间Neuritin和热休克蛋白60（HSP60）的表达，探讨Neuritin和HSP60在大鼠肝损伤修复过程中的作用。方法将126只SD大鼠随机分为肝损伤组、骨折组和正常组，分别检测各组术后6 h、12 h、1d、3d、5d、7d和14d 7个时间点的血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）浓度，并取肝组织行苏木精-伊红和免疫组织化学法染色，观察肝脏病理学改变及Neuritin、HSP60的表达。结果肝损伤组大鼠血清ALT、AST浓度在6 h、12 h、1d时高于骨折组、正常组（P＜0.05）。免疫组织化学法结果表明，肝损伤组大鼠Neuritin和HSP60的表达水平在各个时间点（6 h除外）高于骨折组、正常组（P＜0.05），且两者的表达水平均呈先升高后降低的趋势，骨折组大鼠HSP60的表达水平在12 h、1d时高于正常组（P＜0.05），骨折组大鼠Neuritin的表达水平与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论Neuritin与HSP60相互作用，可能是促进肝损伤修复的重要因素。

肝损伤；骨折；Neuritin；热休克蛋白60

肝损伤在腹部损伤中十分常见，然而肝损伤修复分子机制仍未明确[1-2]。Neuritin是NEDIVI等[3]从大鼠海马cDNA文库中筛选鉴定出与可塑性相关的候选基因，其在神经发育及损伤修复中发挥重要作用。目前Neuritin与肝损伤修复的研究较少，课题组应用基因信息学技术及酵母双杂交技术[4]，在胎脑中发现多条与Neuritin有相互作用的蛋白质和基因，其中包含热休克蛋白60（heat shock protein 60，HSP60）。因此本实验复制大鼠肝损伤模型，探讨Neuritin和HSP60在大鼠肝损伤修复过程中的表达，以及可能的作用机制和意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6周龄SD大鼠购自新疆医科大学实验动物中心。动物合格证号：SCXK（新）2011-0003，饲养设施合格证号：SYXK（新）2011-0001。

1.2 主要试剂及仪器

Neuritin多克隆抗体（型号AF283）（美国R&D公司），HSP60单克隆抗体（型号ab59457）（英国Abcam公司），相应二抗购自北京中杉金桥公司。免疫组织化学法石蜡包埋机及石蜡切片机购自德国Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组及模型的复制126只SD大鼠按随机数字表法随机分为肝损伤组、骨折组和正常组，每组42只。各组再按随机数字表法随机分为6 h、12 h、1d、3d、5d、7d、14d 7个时间点（各6只）。肝损伤组参照第三军医大学大鼠肝脏损伤动物模型[5]，骨折组采用股骨截股模型，大鼠麻醉后，取右下肢股外侧切口暴露股骨干，用电动摆锯将股骨中段锯断，克氏针逆行插入经股骨大转子穿出，将克氏针顺行插入骨折远端复位骨折，将大转子根部针尾部克氏针折弯后剪除多余部分，逐层闭合切口。正常组做空白处理。

1.3.2 血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）浓度的监测麻醉后打开大鼠腹腔，用采血管自下腔静脉采血5 ml，立即4000 r/min离心8 min，取上清液送往石河子大学第一附属医院检验科，由固定的专业人员利用全自动生化仪监测血清ALT、AST浓度。

1.3.3 肝脏组织切片苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）及病理学观察肝损伤组取损伤处肝组织，骨折组和正常组均取左侧肝叶组织，切取的肝组织经甲醛固定后制作石蜡切片，行HE染色，常规显微镜下观察并记录。

1.3.4 免疫组织化学法免疫组织化学法检测Neuritin与HSP60的表达。采用Envision两步法：取制作好的肝组织切片，烘干后脱蜡至水，加热修复抗原，3%双氧水H2O210 min封闭；添加相应一抗4℃孵育过夜；震洗后滴加相应第二抗体，37℃孵育30 min；震洗，显色后进行苏木精核复染，经脱水、透明后封片保存。光镜下观察Neuritin、HSP60的表达，以胞浆呈棕褐色为阳性细胞。结果评分采用AB值法。A：按切片中细胞有无显色及深浅评分，细胞无着色计0分；显色为浅黄色计1分；深黄色计2分；棕褐色计3分。B：按切片中显色细胞比例评分，显色细胞＜1/3切片中细胞总数计1分；1/3～2/3细胞显色计2分；＞2/3细胞显色计3分。每例样本积分= A×B。每张切片在200倍光镜下随机选取5个无重叠视野，评分后取算术平均值进行下一步统计学处理。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清ALT、AST浓度比较

肝损伤组大鼠血清ALT、AST浓度在6 h、12 h、1d时高于骨折组和正常组（P＜0.05），其余时间点3组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。骨折组AST浓度在6 h、12 h、1d时升高，且与肝损伤组及正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、2。

2.2 肝脏病理学变化

光镜下观察各组大鼠肝脏组织。肝损伤组大鼠6 h～1d可见肝小叶结构破坏，周边见红色出血带，肝窦内可见大量红细胞，部分肝细胞水肿；肝损伤后3和5d，肝细胞索结构紊乱，仍可见出血，肝小叶周边细胞普遍增大，胞浆水肿，局部点状坏死，偶见核分裂象，肝血窦周围可见炎症细胞浸润；肝损伤后7和14d，出血明显减少，仍见淋巴细胞及中性粒细胞浸润，内皮细胞明显增多，可见新生毛细血管形成。骨折组大鼠肝脏肝小叶结构稍紊乱，局部细胞质疏松，可见少量炎症细胞。见图1。

表1 各组不同时间点ALT浓度比较 （n =6，u/L，±s）

注：†与正常组、骨折组比较，P ＜0.05

组别 6 h 12 h 1d 3d 5d 7d 14d肝损伤组 104.17±4.07† 424.50±10.84† 64.00±7.15† 40.33±7.56 44.83±11.70 36.33±9.95 43.17±6.18骨折组 44.00±5.02 43.00±4.56 42.33±5.46 38.17±6.24 39.67±8.98 42.00±5.41 43.17±10.30正常组 38.83±6.61 40.00±6.19 42.17±9.95 39.50±5.89 47.00±7.04 41.50±6.65 43.50±8.45 F值 277.617 4981.180 15.767 0.184 0.956 0.960 0.0030.000.003 P值 0.000 0.000 0.000 0.834 0.407 0.405 0.997

表2 各组不同时间点AST浓度BJ （n =6，u/L，±s）

表2 各组不同时间点AST浓度BJ （n =6，u/L，±s）

注：1）与正常组比较，P ＜0.05；2）与骨折组比较，P ＜0.05

组别 6 h 12 h 1d 3d 5d 7d 14d肝损伤组 271.00±15.831）2）787.67±32.681）2）210.17±18.691）2） 93.50±12.80 76.50±7.14 69.83±9.13 63.33±9.13骨折组 127.50±7.011） 185.17±10.741） 143.00±19.601） 83.17±9.63 69.83±12.60 65.00±7.62 67.33±8.61正常组 65.50±8.552） 68.83±12.772） 77.33±14.282） 77.00±9.19 71.83±10.15 67.50±9.40 71.33±6.56 F值 536.192 1990.628 90.890 3.688 0.673 0.458 1.088 P值 0.000 0.000 0.000 0.050 0.525 0.641 0.362

图1 肝脏病理学变化 （HE染色×200）

2.3 肝脏组织Neuritin、HSP60的表达

2.3.1 Neuritin光镜下观察Neuritin、HSP60均表达于细胞浆，着色肝细胞围绕汇管区分散排列。肝损伤组在各时间点（6 h除外）Neuritin评分高于骨折组和正常组（P＜0.05）；各时间点的表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），且随时间推移，表达呈先升高后下降的趋势。随时间推移，骨折组与正常组的表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；且各时间点比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2和表3。

2.3.2 HSP60肝损伤组HSP60的表达水平也呈先升高后下降的趋势，且在12 h、1d、3d、5d、7d、14d时的评分高于骨折组和正常组（P＜0.05）。骨折组HSP60的表达随着时间变化，差异有统计学意义（P＜0.05），且在12 h、1d时表达水平较正常组高（P＜0.05），其余时间点比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4和图3。

图2 Neuritin在肝组织中的表达 （免疫组织化学法染色×200）

表3 各组不同时间点Neuritin评分比较 （n =6，分，±s）

表3 各组不同时间点Neuritin评分比较 （n =6，分，±s）

注：†与正常组、骨折组比较，P ＜0.05

组别 6 h 12 h 1d 3d 5d 7d 14d肝损伤组 0.73±0.16 1.57±0.23† 2.23±0.29† 3.47±0.33† 4.07±0.30† 2.90±0.27† 1.97±0.23†骨折组 0.43±0.19 0.27±0.20 0.47±0.24 0.60±0.18 0.57±0.29 0.37±0.23 0.43±0.15正常组 0.30±0.11 0.47±0.16 0.43±0.15 0.44±0.16 0.31±0.10 0.27±0.16 0.40±0.17 F值 1.194 71.129 113.611 324.421 420.035 254.788 131.890 P值 0.330 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 各组不同时间点HSP60评分比较 （n =6，分，±s）

表4 各组不同时间点HSP60评分比较 （n =6，分，±s）

注：1）与正常组比较，P ＜0.05；2）与骨折组比较，P ＜0.05

组别 6 h 12 h 1d 3d 5d 7d 14d肝损伤组 1.90±0.27 3.10±0.211）2） 3.40±0.281）2） 4.57±0.291）2） 6.10±0.281）2） 4.03±0.291）2） 2.87±0.321）2）骨折组 1.57±0.29 2.53±0.271） 2.90±0.211） 1.56±0.30 1.50±0.21 1.47±0.21 1.67±0.21正常组 1.70±0.21 1.27±0.162） 1.50±0.212） 1.53±0.24 1.60±0.28 1.37±0.23 1.57±0.32 F值 2.452 109.128 103.929 235.374 621.300 223.514 37.381 P值 0.120 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

图3 HSP60在肝组织中的表达 （免疫组织化学法染色×200）

3 讨论

Neuritin最初被认为是一条高度限制在神经系统表达的基因，ZITO等[6]研究发现，Neuritin基因的过表达增强神经元细胞对神经生长因子（nerve growth fact，NGF）的应答,从而刺激神经元突起的生长及神经元细胞的迁移。在胎鼠脑发育时期，Neuritin过表达可以阻断Caspase-3的活性,而抑制皮层细胞的凋亡。Neuritin可以作为NGF共同发挥作用的下游因子，与神经组织可塑性密切相关[7]。然而随着研究深入，Neuritin在机体其他组织中也有表达，并介导神经系统外组织的再生，Neuritin促进真皮微血管内皮细胞聚集和增殖，在血管领航和网络形成中发挥导向作用[8]。Neuritin与肝损伤修复的研究鲜见报道，日本学者在切除70%小鼠肝脏后，Neuritin在肝脏的表达呈上升趋势，随着肝脏再生，Neuritin基因表达也上升[9]。本研究结果也证实，Neuritin在肝脏组织中表达，并且在肝脏损伤后Neuritin表达水平从12 h开始呈先升高后下降的变化趋势，贯穿于肝脏损伤后的修复进程，而且其表达水平高于骨折组和正常组，因此笔者推定Neuritin参与肝组织的损伤、修复过程，可能对肝细胞的发育或再生起重要作用，具有潜在的临床价值。

HSP60是线粒体内最主要的分子伴侣蛋白之一，生理状况下其主要参与蛋白质的转运、折叠等。在机体受到损伤时，HSP60作为一种应激蛋白抵御各种损害因素的影响。研究发现，应激状态下HSP60发挥分子伴侣作用，调节靶蛋白的活性和功能，从而保护细胞生存[10]。HSP60可以与抗凋亡因子Bcl-XL蛋白相互作用，当激活线粒体凋亡通路时，HSP60过表达可增加Bcl-XL基因的表达，降低促凋亡因子Bax的表达量，从而稳定线粒体膜电位，抑制Caspase-3通路激活，减少细胞凋亡[11-12]。HSP60也可能参与肝脏的再生，SHI等[13]研究报道，HSP60在切除2/3小鼠肝脏组织后，修复早期表达升高，从而激活库普弗细胞表面的Toll样受体，分泌白细胞介素6、肿瘤坏死因子等细胞因子，在肝脏损伤修复中具有重要作用。本研究发现，骨折组12 h、1d时 HSP60在肝脏表达量较正常组升高，AST浓度在6 h、12 h、1d时也升高，HSP60在骨折创伤后表达升高可能是作为应激蛋白，抵御骨折创伤带给肝细胞的危害。而在肝损伤组，HSP60的表达与Neuritin的表达变化趋势一致，从12 h开始升高，且高于骨折组和正常组，因此笔者认为HSP60可能不仅仅作为一种应激蛋白起防御保护作用，HSP60可能也参与了肝脏的创伤修复过程。

ALT、AST是反映各种功能的经典指标，ALT、AST升高及肝组织切片明确大鼠肝脏损伤，肝脏损伤后肝细胞通过强大的再生能力使自身结构和功能恢复，其修复过程有多种细胞及因子参与。本研究首次证实，Neuritin和HSP60在受损肝组织的时相性表达，都呈先升高后下降的变化趋势，而且笔者注意到HSP60与Neuritin在机体组织具有共同的作用。两者都在蛋白质的跨膜转运起重要作用，都参与细胞周期及凋亡进程，应激状态是都可以过表达或异位表达。

综上所述，推测HSP60和Neuritin都可能参与肝脏的创伤修复过程，两者作用机制可能是HSP60和Neuritin的过表达及相互作用，调节细胞周期抑制受损肝细胞凋亡，辅助相关蛋白的跨膜转运，促进细胞增殖发育，维持组织可塑性。本研究将为进一步研究Neuritin和HSP60在肝损伤修复过程中的具体作用，以及机制奠定理论基础，为肝细胞受损后再生修复提供新思路。

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Expressions of neuritin and HSP60 in traumatically-injuried liver tissue of rats*

Jiang-wen Wu, Mei-yi Zhu, Jun Ouyang, Tao Zhou,dong Cao

(Department of Emergency Surgery, the First Aff i liated Hospital of Medical College of Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832008, China)

ObjectiveTodetect the expressions of neuritin and HSP60 in traumatic liver tissues of rats at different time, anddiscuss the effect of neuritin and HSP60 on the repair of injuried hepatic tissue.MethodsOne hundred and twenty-six SD rats were randomlydivided into liver injury group (group A), fracture group (group B) and normal group (group C). In each group, the serum concentrations of ALT and AST were respectively measured at seven time points (6 and 12 h, 1, 3, 5, 7 and 14d), HE staining and immunohistochemical method were used todetect the expressions of neuritin and HSP60 in the liver tissue of the rats.ResultsAt the time of 6 h, 12 h and 1d, serum concentrations of ALT and AST in the group A were higher than those in the group B and the group C (P＜ 0.05). The immunohistochemical staining results indicated the expressions of neuritin and HSP60 in the group A at the time points from 12 h to 14d were significantly higher than those in the group B and the group C (P＜ 0.05). The expression of HSP60 in the group B was higher than that in the group C at 12 h and in 1d (P＜ 0.05). And the expressions of neuritin and HSP60 increased at first and thendecreased.ConclusionsThe interaction between neuritin and HSP60 may play an important role in hepatic self-repair after traumatic liver injury.

liver injury; fracture; neuritin; heat shock protein 60

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.02.002

1005-8982（2018）02-0008-06

R575.3

A

2016-11-16

国家自然科学基金（No：81560312）

欧阳军，E-mail：wenf010@163.com

（童颖丹 编辑）