创伤性骨髓炎骨缺损动物模型构建的研究进展

曾庆亮 丁海

近年来随着创伤患者的增多，创伤性骨髓炎的患者也逐渐增多，如开放性骨折直接污染，或骨折手术，特别是内固定术后出现的骨髓炎，增加了骨折术后严重并发症—感染的发生。尤其是金属内固定植入后的感染，常导致金属内固定的取出、扩大清创、再次植入及骨不愈合等严重后果[1～3]。该疾病的病因、发展及治疗是现在骨科研究的热点。近年来，人工生物材料及生物载体系统的产生及研究，为治疗创伤性骨髓炎骨缺损带来了希望[4]。随着创伤性骨髓炎骨缺损动物模型的深入研究，创伤性骨髓炎骨缺损动物模型的建立能够为人工生物材料及生物载体系统的研究提供有效的方法。目前创伤性骨髓炎骨缺损模型是利用创伤后感染形成骨髓炎的方法来构建创伤后感染骨缺损模型[5～7]。主要步骤包括创伤、接种细菌（种类和浓度）、动物的选择、制造骨缺损（部位与大小），模型构建后骨髓炎指标的检测及动物的护理等。本研究通过查阅分析大量关于骨髓炎骨缺损模型构建的最新研究，以对此作出展望。

1　创伤性骨髓炎骨缺损动物模型构建的细菌种类

1.1金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus，SA）是骨髓炎最常见的致病菌[8,9]。因此在创伤性骨髓炎骨缺损动物模型的构建中以SA作为首选。张小磊等[10]用22只新西兰兔，于下颌骨体外侧近正中联合处开骨窗注入鱼肝油酸钠和5×108CFU/ml SA（ATCC29253），6周后全部出现骨质破坏、骨膜反应、软组织炎症等骨髓炎表现。唐辉[11]等利用3mm克氏针在新西兰兔胫骨近端开约0.5cm×0.5cm骨窗，并注入浓度为6×105CFU/ml SA（ATCC29213）悬浮液和鱼肝油酸钠，3周后出现骨质破坏、骨膜反应、软组织炎症等骨感染表现。在兔骨髓炎骨缺损的构建中，还有其他因素如细菌浓度、建模部位、血供等因素影响模型构建的成功率。Chen[12]等在大鼠股骨制造6mm骨缺损后，接种1×104CFU/ml的金黄色葡萄球菌，2个月后再接种1×104CFU/ml，较好地形成节段性骨缺损感染模型且不影响固定装置的稳定性。Lindsey 等[5]研究发现，大鼠股骨接种1×102CFU/ml SA 即能达到90%以上的动物出现骨髓炎症状。Williams等[13]利用模拟羊胫骨近端开放骨折，同时使用涂有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （MRSA）生物膜接骨板作为内固定建立模型。但目前多数研究表明[14，15]使用SA作为感染菌种，骨髓炎动物模型均建模成功。

1.2铜绿假单胞杆菌和大肠埃希菌 研究表明除SA外，铜绿假单胞杆菌和大肠埃希菌感染也会导致创伤性骨髓炎[8，9]。对于铜绿假单胞杆菌及大肠埃希菌是否能导致骨髓炎，有些学者做了一些研究，如Kanellakopoulou 等[16]将铜绿假单胞菌接种在36 只新西兰大白兔胫骨上段，14d后全部动物出现局部软组织肿胀体征，但49d后，其中有11只未出现明显的骨膜反应、骨破坏、死骨形成、软组织肿胀等骨感染表现，余25只出现骨破坏、死骨形成、软组织肿胀和死腔窦道流脓表现，成功率为69.4%。该研究表明铜绿假单胞菌可以诱导产生创伤性骨髓炎模型。但接种铜绿假单胞菌的适宜浓度及接种方式未明确指出，还有待研究，成功率也不高。Passl等[17]将7只豚鼠用无菌电锯截断股骨后接种1×105CFU/ml的大肠埃希菌，28d后7只豚鼠均出现明显的骨膜反应、骨破坏、死骨形成、软组织肿胀表现，90d后有6只豚鼠细菌培养检查出现阴性，只有1 只豚鼠细菌培养出大肠埃希菌和铜绿假单胞菌混合菌落，成功率为14.3%，可见大肠埃希菌诱导产生创伤性骨髓炎骨缺损模型成功率并不高。大肠埃希菌感染可能与患者自身有关，创伤可以导致胃肠道应激反应，使肠道水肿从而导致肠道壁通透性增加，再加上细菌产物导致的局部炎症反应、内毒素和免疫微环境变化等可以产生全身及局部反应，作用于肠道可以使大肠埃希菌穿过肠道进入感染部位，具有一定的自限性，但是局部炎症反应和炎症介质的作用可使其他细菌（如SA）的侵袭性增强继而出现混合感染。

1.3其他细菌 除此以外，研究中用到的细菌还有厌氧菌及鲍曼不动杆菌。霍茜瑜等[18]用浸有鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌的钢针分别插入小鼠胫骨干骺端，11d后小鼠均出现胫骨周围软组织密度增高、骨膜增生，骨破坏等表现，进一步研究发现鲍曼不动杆菌实验组的骨髓炎严重程度较金黄色葡萄球菌对照组轻，本方法成功建立了由鲍曼不动杆菌引起的骨髓炎动物模型。但其致骨髓炎效果不强，故很少采用。

2　接种细菌的方式与浓度

骨髓炎动物模型按照细菌接种的途径分为：静脉注射模型、局部注射（接种）模型、生物载药系统模型[19]。Rodet[20]通过直接静脉注射SA到兔体内建立骨髓炎模型，但是实验最后发现该方法易导致实验动物的死亡及难以构建出骨髓炎模型，故静脉注射构建骨髓炎动物模型比较困难。另一种方法为克氏针骨髓腔钻孔接种，Norden[21]通过研究菌落接种发现单独应用鱼肝油酸钠或葡萄球菌在14d或60d时无明显骨髓炎症状，而同时应用鱼肝油酸钠和葡萄球菌在60d和180d时90%的动物表现出骨髓炎症状，故同时接种细菌及硬化剂封闭是构建骨髓炎动物模型成功的重要条件。Horn 等[22]认为若想达到100%的感染率，注入的细菌浓度应在106～108CFU/ml之间。但是有些研究[23]发现如果接种细菌浓度过高，容易导致动物死亡。而Lindsey等[5]研究发现，大鼠股骨接种细菌量在1×102CFU/ml的SA即能达到90%以上的动物出现骨髓炎症状。说明接种细菌浓度对骨髓炎骨缺损动物模型的构建成功率的影响较小。该研究认为细菌通过释放一些改变动物体内局部微环境的物质来影响接种细菌的增殖，继而对骨髓炎模型的构建产生影响。故有关于接种细菌悬液的浓度对骨髓炎动物缺损模型的构建是否有影响还需进一步研究。

3　动物种类

在构建创伤后骨髓炎骨缺损动物模型时，模型动物在解剖学和疾病发展规律上应与人类相似，常用的动物有新西兰兔、鼠，狗、猪、羊等较少用。一些研究认为大鼠比较适合用于感染性骨缺损的研究[24]，因为大鼠具有成本低、耐受广谱抗生素治疗和支持较少内固定的优点。但是大鼠具有一定的攻击性，手术操作较为精细，不容易掌握，其次，作为小型动物，解剖结构及疾病发展规律与人类有一定相差，故应合理选取大鼠动物模型。兔、犬、猪等动物骨架偏大，手术操作较为容易，解剖结构及疾病发展规律与人类相似，可以作为理想的实验动物[25]。但犬和猪实验成本较高，不易饲养，且犬和猪具有攻击性，故不能作为普通实验动物使用，因此兔是比较常用的骨缺损模型动物。新西兰大白兔大小合适、性格温顺、易于得到，解剖结构与人体类似，手术操作方便，适宜作为骨髓炎骨缺损研究的模型动物[26]。此外，兔可作为创伤性骨髓炎骨缺损的研究部位较多，常用的部位有：颅骨、下颌骨、桡骨、股骨干、胫骨等。每个部位都有着自己的优缺点[27，28]。

4　造模部位及骨缺损尺寸的选择

构建骨髓炎骨缺损动物模型时应考虑造模部位。骨缺损自我修复能力受多种因素影响：如缺损是否超过临界值、缺损部位血供是否完善、动物的年龄及营养状态等[29]。非负重骨常用的有桡骨、下颌骨、颅骨等，负重骨有股骨、胫骨等[30，31]。由于临床中常见的骨缺损多发生在负重骨，故造模部位多选在负重骨。临界性骨缺损（critical size defect，CSD）是动物模型的重要参数，它是指动物不能自我修复愈合的最小骨缺损值，在不同的部位最小骨缺损值不同，Schmitz等[32]将CSD进行量化，认为骨缺损大小为其骨干直径1.5～2.5 倍长度时可以导致骨不愈合。但这种方法并不适用于骨髓炎所致骨缺损的量化研究，因为除骨缺损临界值外，影响骨髓炎骨缺损的因素还包括接种浓度、接种细菌类别、接种方式、糖尿病、免疫力低下等因素。因此在构建和研究骨髓炎骨缺损模型时需要充分考虑上述因素。即使消除多数混杂因素也难以保证造模的差异性很小，故骨髓炎骨缺损的部位和大小难以固定，后续研究更需要探究可以用于量化的指标。

5　创伤性骨髓炎骨缺损模型的检测

创伤性骨髓炎骨缺损模型构建完成后，建模是否成功要依据一些方法进行检测。常用的检测方法包括大体观察、生化指标、细胞学、影像学、微生物学和组织学结果[33]。①大体观察：骨缺损部位是否有红肿渗出、局部皮温增高、窦道形成等；②生化指标：C 反应蛋白（CRP）增高、红细胞沉降率（ESR）加快和白细胞计数升高，中性粒细胞比值增大可作为创伤后骨髓炎骨缺损动物模型构建后的检测；③局部分层穿刺：对早期的诊断有重要价值。穿刺液涂片检查有脓细胞或细菌则可明确诊断；④X线检查：有骨破坏、骨膜反应、死骨形成等表现；⑤近年来随着核医学的兴起，显微ECT-CT 开始用于骨髓炎骨缺损模型的术后检测，其优点是能早期发现骨感染，但其检查麻烦及对诊断骨髓炎的特异性不高；⑥MRI：该检查对病灶敏感性高、特异性强，T2像炎症病变信号加强，检查便利，对早期诊断有一定的价值。在构建骨髓炎骨缺损动物模型后还可以通过手术活检的办法来确定类别。

6　小结与展望

随着骨髓炎骨缺损动物模型构建的大量研究，发现有多种方法可以构建骨髓炎骨缺损动物模型，但是提高建模的成功率需注意动物种类、建模部位、注入细菌方式和适宜浓度的选择，故如何更好地构建骨髓炎骨缺损的动物模型仍需要更深入的研究。今后研究需要注意以下问题：①创伤性感染与骨缺损的手术步骤的先后顺序；②大型动物解剖结构及疾病发展过程与人类相似，故应克服大型动物建模的缺点，更多地构建大型动物的模型；③完善创伤性骨髓炎骨缺损量化指标；④随着创伤后感染骨缺损治疗方法的深入研究，能否实现多种途径联合应用，找出更简便、有效的方法。