谷子SibZIP8转录因子基因功能鉴定

刘盼，张艾英，张莉*

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801；2.山西省农业科学院 谷子研究所，山西 长治 046011)

谷子(Setariaitalica)具有耐贫瘠、抗旱和适应能力强等优良品质，距今已经约有8700年的种植历史，是一种重要的杂粮作物[1]，也是植物抗逆性研究的理想模型。尤其是谷子全基因组测序[2，3]和众多转录组测序的完成[4]，为其功能基因组学的研究提供了良好的数据平台。

目前，全球极端气候变化愈演愈烈，中国水资源分布并不均衡，在很多地方干旱、盐碱情况非常严重，面对这样的现状，植物特别是农作物自身克服这种逆境威胁的能力有限，导致大幅度减产。因此增强农作物对逆境胁迫的耐受性研究越来越重要，而通过转基因技术对谷子进行抗逆改良是一项重要的措施。

转录因子是一类可以识别且结合目的基因启动子特定位点并能够激活或抑制基因表达的活性蛋白[5]，在植物的抗逆胁迫中发挥重要的作用。碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZIP)转录因子是众多转录因子中一类数目最庞大、最保守的基因家族,遍布植物、哺乳动物、昆虫以及微生物等真核生物基因组中[6]。有研究表明，蓝氏贾第鞭毛虫中的bZIP基因是真菌、动植物bZIP转录因子的共同祖先，这些bZIP家族成员在进化过程中发生了分歧[5]。

在植物中，已在高粱[7]、拟南芥[8]、玉米[9]、水稻[10]等植物中鉴定到了完整的bZIP基因家族。植物bZIP蛋白具有典型的二聚体结构特征,其C端有1个碱性氨基酸区,N端有1个亮氨酸拉链[11，12],二者构成保守的bZIP结构域，能够识别特定的DNA序列。当植物处于逆境时可以抑制或激活下游基因的转录，增强植物对外界环境的适应能力。在种子、花的发育，病原菌入侵，干旱及盐胁迫应答等多种生物和非生物胁迫反应中起重要的调控作用[13～17]。

前期我们采用生物信息学分析的方法，对谷子SibZIP转录因子基因家族进行了鉴定，共获得75个家族成员[18]。利用转录组测序的数据，对谷子75个SibZIP转录因子基因的组织特异性表达进行了分析，结果发现多个SibZIP基因得到了不同程度的提高，其中SibZIP8的表达量增加最为明显[18]。为了进一步研究SibZIP8基因的功能，我们构建了SibZIP8基因的超量表达载体，转化拟南芥，通过抗性筛选和PCR鉴定获得阳性转基因植株，并对转基因植株进行抗盐性分析。本研究结果将为转基因育种技术提高作物抗逆性奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究中使用的拟南芥为Columbia 生态型，由山西农业大学分子生物实验室保存；大肠杆菌感受态DH5α，农杆菌感受态GV3101和植物表达载体pCAMBIA1302由山西农业大学分子生物实验室提供；MS (Murashige-Skoog) 培养基(江莱生物公司，MSP05-10LT)，植物DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP305-02)；Pfu高保真聚合酶(天根生化科技(北京)有限公司，EP101-01)等。

1.2 方法

1.2.1SibZIP8基因的克隆

根据已知的SibZIP8cDNA序列设计合成一对引物，然后在引物的5’端分别引入Nco1和BstZ171酶切位点。引物序列如下：正向引物：5′-CCATGGATTTCCCGGGCGGG-3′，反向引物：5′-TCCTTGGTAGGGTGACC-3′,以反转录得到cDNA作为模板，用Pfu高保真聚合酶，建立PCR反应体系：预变性：95 ℃、5 min，变性：95 ℃、1 min，退火：56 ℃、1 min，延伸：72 ℃延伸1 min，30次循环。在PCR扩增产物中提取目的条带，然后在1%的琼脂糖凝胶中检测，最后用回收试剂盒回收目的DNA。

1.2.2 超量表达载体的构建

同时用限制性内切酶Nco1和BstZ171对质粒pCAMBIA1302和上一步PCR扩增产物进行双酶切，然后再用DNA凝胶电泳回收试剂盒对质粒进行割胶回收，目的片段通过T4连接酶与载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得重组质粒即pCAMBIA1302-SibZIP8超量表达载体，然后采用热击法将植物的表达载体导入农杆菌空菌株中，培养筛选检验得到阳性重组农杆菌单菌落。

1.2.3 拟南芥的培养

将拟南芥的种子均匀撒播于配制好的营养土中，用保护膜覆盖住，4 ℃下黑暗春化处理2天。之后转移到温室中培养至幼苗出土以后去除保护膜，继续培养28天后再进行转化试验。

1.2.4 拟南芥的转化

取阳性农杆菌单菌落于300 μL 液体LB培养基中28 ℃、300 r·min-1培养2天，测试该菌液于600 nm波长处的吸光值为1.0～1.5。在4 000 r·min-1条件下离心15 min，弃去上清液。加入农杆菌培养液重新悬浮使其在600 nm波长处的吸光度约为0.8，采用改良的花序侵染法转化拟南芥，收获第一代种子(T0)并干燥保存。

1.2.5 纯合转基因拟南芥株系的获得和检测

在带有HYG-潮霉素的MS培养基上播种T0转基因拟南芥种子，在温室培养10 d后，挑选得到T1阳性植株，将其移植培养土中，收获种子，再次播种，每个系播种6株(T2)，并在拟南芥开花前从拟南芥中提取DNA，对提取出来的DNA进行PCR检测。

1.2.6 转基因拟南芥抗盐性试验

将纯合转基因拟南芥与野生型拟南芥进行春化处理后，点播在1/2MS培养基上,分别加入1.5 μmol·L-1ABA,300 mmol·L-1mannitol,200 mmol·L-1NaCl观察结果，统计其发芽率，每个品系重复试验3次。

2 结果与分析

2.1 SibZIP8基因的克隆及表达载体构建

采用1.2.2的试验方法，构建了pCAMBIA1302:SibZIP8超量表达载体，为了进一步确认载体是否构建成功，选择任一阳性克隆送公司测序，经序列比对，序列片段与拟南芥资源信息(TAIR) 网站上公布的序列完全相同。

2.2 SibZIP8的亚细胞定位分析

利用上面克隆得到的SibZIP8cDNA序列，构建到含有GFP报告基因的pCsGFPBT载体中，通过农杆菌介导的方法使SibZIP8在烟草叶片中表达，然后使用激光扫描共聚焦显微镜观察SibZIP8-GFP融合蛋白的定位情况，发现其定位于细胞核内(图1)。

图1 SibZIP8-GFP融合蛋白的亚细胞定位Fig.1 SibZIP8-GFP subcellular localization

2.3 转基因阳性拟南芥植株的检测

为了验证转基因植株整合有目的基因SibZIP8，设计引物SibZIP8F和SibZIP8R，通过PCR检测T2转基因植株。从图2中的PCR检测结果可以看出，除了1个植株未获得目的基因片段外，其余20株转基因植株都获得了目的基因。

图2 转基因拟南芥植株的PCR检测Fig.2 PCR analysis of transgenic Arabidopsis注：数字1～6分别代表T2代转基因植株,“-”代表阴性对照，“+”代表阳性对照，WT代表野生型，M 代表分子标准。Note:Number 1～6 stands for the lines of transgenic plants,‘+’stands for positive control,‘-’ stands for neganive control,WT means wild type,M means marker

2.4 转基因拟南芥抗盐性表型鉴定

图3 转基因拟南芥的发芽试验Fig.3 Germination experiment of transgenic ArabidopsisA：MS培养基上包含1.5 μmol·L-1 ABA；B:MS培养基上包含200 mmol·L-1 NaCl；C：MS培养基上包含300 mmol·L-1 mannitol

对PCR筛选得到的阳性植株，进行表型鉴定。如图3A所示：在1.5 μmol·L-1ABA处理下，野生型拟南芥与转基因拟南芥都没有发芽；在300 mmol·L-1mannitol处理下(图3C)，野生型拟南芥区域与转基因拟南芥均有发芽，没有明显差别；在200 mmol·L-1NaCl条件下(图3B)，野生型拟南芥没有发芽，而转基因拟南芥在推迟3天后均发芽。

3 讨论与结论

植物的bZIP转录因子可参与调控植物多项生长发育过程，在植物抵抗逆境胁迫等过程起着重要的调控作用[19]。我们前期通过生物信息学分析的方法，对谷子SibZIP转录因子基因家族进行了系统的分析，逆境处理下的转录组测序数据以及qRT-PCR的分析结果均表明逆境条件能够诱导SibZIP8的表达。

谷子抗旱耐瘠，是研究逆境胁迫调控很好的模式植物，但是由于谷子的转化体系尚不成熟，目前并不具备在谷子中进行基因过表达的条件。因此本试验选择在模式植物拟南芥中过表达SibZIP8基因，并对过表达植株的耐盐性进行了分析。试验结果表明，转基因植株有良好的耐盐表型，在200 mmol·L-1NaCl条件下能够正常萌发(图3B)。Ying S等研究发现玉米ZmbZIP72转录因子在拟南芥中过量表达后，转基因拟南芥对干旱与高盐胁迫的耐受性增强[20]。这与我们的研究结果一致，表明bZIP转录因子在植物抵御逆境胁迫的过程中能够发挥作用。此外，bZIP转录因子还能够同其他基因协同表达，提高植物的抗逆性。如在白桦中，Zhao等人证实ThbZIP1和ThLEA基因的协同表达增强了烟草在盐胁迫下的耐受性[21]。此类研究均表明bZIP转录因子在植物抗逆境胁迫中发挥重要作用。

本文以谷子为研究材料，克隆得到谷子SibZIP8基因，通过qRT-PCR发现其表达量在干旱和盐胁迫下显著增加。亚细胞定位表明其定位于细胞核内。SibZIP8超量表达提高了转基因拟南芥对盐胁迫的抗性，表明SibZIP8转录因子参与调控植物高盐胁迫，为提高作物的抗盐性提供了新的基因资源。

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