牛至草醇提物的抗氧化与抗炎、止咳祛痰作用研究*

早克然·司马义，麦合苏木·艾克木△，于 洋，阿不都热依木·玉苏甫

1.新疆医科大学维吾尔医学院 (乌鲁木齐 830011)，2.新疆维吾尔自治区中医民族医药管理局(乌鲁木齐 830001)

牛至草是一种维吾尔医常用药材，以牛至草(Origanum valgare)的干燥地上部分入药，维吾尔语名为“买尔赞柱西”，药性属二级干热，具有消散寒气、开通湿阻、成熟及清除异常体液、利尿通经、增强营养吸收、促进机体自然随和、止咳化痰、平喘利肺、消肿止痛等功效，用于粘稠异常体液性咳喘、感冒、头痛、脉络闭阻性胸闷气短、形体消瘦、心烦身疲、食欲不振、尿少肢肿[1-3]。它也是新疆特色药用植物之一，分布于天山、阿勒泰山区、准噶尔西部等区[4]，资源丰富。文献报道[5-6]，牛至草含有挥发油、多酚、黄酮、萜类等化合物，国内外相关药理活性研究主要集中于其挥发油类成分。在维吾尔医及民间常以牛至草醇提物或水煎液用于治疗咳喘、感冒、支气管炎等疾病的治疗，疗效显著。因此，本实验对牛至草醇提物的体外抗氧化能力进行了评价，同时对其总多酚、总黄酮含量进行了测定，并对其抗炎、止咳、祛痰作用进行了研究，以期为牛至草的临床应用和进一步研究提供参考。

材料与方法

1 材 料

1.1 仪器：OSB-2100恒温水浴锅(上海爱郎仪器有限公司)，DZKW-S-4型电热恒温水浴锅、DZF-6090型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，KQ320ODE数控超声波清洗器(昆明市超声仪器有限公司)，AK-800A 400g摇摆式中药粉碎机(温岭市奥力中药机械有限公司)，VV-240型紫外可见光光度计(上海凌光技术有限公司)，艾柯纯水仪(成都市康宁实验专用纯水设备厂)，KDC-2044型低速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)。402A型雾化器(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)。

1.2 药品与试剂:抗败血酸(上海蓝季生物，批号：160625)，DPPH·(日本)，磷酸盐缓冲液(中国，天津)，Tris-Hcl缓冲液(中国，北京Solarbio)，芦丁对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：Y01M7S10307)，没食子对照品(中国食品药品鉴定研究院，批号：110831-201204)，福林酚(源叶生物，批号：S28F8J)。急支糖浆(太极集团重庆涪陵制药厂有限公司，批号：14101248 0551)，苯酚红(成都市科龙化工试剂厂，批号：20160510)，生理盐水(国药集团新疆制药有限公司，批号：1608008)。其余试剂均为分析纯。

1.3 实验动物:昆明种小鼠18～22g，均为清洁级、雌雄兼用，由新疆医科大学实验动物中心提供[生产许可证：SYXK(新)2011-0001]。

1.4 药材:牛至草药材购自新疆维吾尔自治区维吾尔医医院，经该医院质检部鉴定为是唇形科植物牛至草(Origanum valgare)的干燥地上部分。

2 方 法

2.1 NZEt的制备:取牛至草药材，切碎，粉碎，过筛。称取3kg牛至草粉末，采用回流法以95%乙醇为提取溶剂提取两次，料液比为1∶15，每次1.5h，滤过，合并滤液，浓缩至约1000 ml，抽滤。真空干燥，得NZEt，备用。

2.2 NZEt的体外抗氧化活性

2.2.1 对DPPH·自由基清除能力的测定[6-7]：用纯水溶解NZEt，配置成不同浓度梯度的溶液，依次为0.2 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml，置于冰箱保存备用。DPPH·配置成0.1 mg/ml的DPPH甲醇溶液。取各浓度样品2 ml到西林瓶中，加2 ml DPPH甲醇溶液，避光反应30 min ，在517 nm处测定清除后OD值为(A1)；取各浓度样品2 ml到西林瓶中，各加2 ml甲醇，测得样品OD值为(A2)；以水为空白对照，以上水代替样品溶液，取2 ml水到西林瓶中，加DPPH甲醇溶液2 ml，混合后测量未清除OD值为(A3)；预实验显示，VC浓度为2.0 mg/ml时，清除率与各浓度牛至草醇提物的清除率最接近，故以此浓度VC作为阳性对照[11]，做3次平行。清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100%。

2.2.2 还原能力的测定[8]：用甲醇溶解NZEt，配制成不同浓度的溶解(0.1mg/ml、0.2 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml)2 ml于10 ml试管中，依次加入磷酸盐缓冲液(pH=6.8)分别2ml，1%铁氰化钾溶液2 ml,混合后50℃水浴20 min，再加入10%三氯乙酸溶液2 ml，混合后3000 r/min离心10 min，取上清液2 ml于西林瓶中，加入纯水2 ml和0.1%三氯化铁0.4 ml，常温反应5 min，于700 nm处测定OD值。预实验显示，0.1 mg/ml VC的吸光度值与各浓度牛至草醇提物的吸光度值比较最为符合，故以此浓度VC作为阳性对照，做3次平行。

2.2.3 对·OH的清除能力的测定[9-10]：用蒸馏水溶解NZEt配制成不同浓度梯度的溶液(0.1mg/ml、0.2 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml)。在具塞试管中加入4.5ml pH=7.4磷酸盐缓冲液和1.5ml 1.5mmol/L的邻二氮菲溶液，充分混匀，加入1ml 1.5mmol/L FeSO4溶液，立即混匀，加入1ml待测液，充分混匀，再加入1ml 0.02% 双氧水；另做损伤管，其中加入1ml 0.02% 双氧水与蒸馏水，未损伤管不加双氧水直接加入2ml蒸馏水(未损伤管和损伤管均用磷酸盐缓冲液调零)于37℃保温60min,510nm处测定A值。预实验显示，0.1 mg/ml VC清除羟基自由基的效果与NZEt最高浓度时的清除率最接近，故以此浓度VC为阳性对照，每组设计3次平行，重复3次。清除率(%)=[(A样-A损)/(A未-A损)]×100%。

2.3 NZEt总黄酮和总多酚含量测定

2.3.1 NZEt总黄酮含量的测定[11]：以芦丁作标准曲线，精密称取芦丁对照品10 mg，置50 ml容量瓶中，加80%乙醇溶解至刻度，摇匀即得对照品溶液。分别精密吸取1.0ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml和5.0 ml置于10 ml比色管中，各加80%乙醇至5 ml，加5%NaNO2溶液0.5 ml，摇匀放置6min，再加10%Al(NO3)溶液0.5 ml，摇匀放置6min，加入4%NaOH溶液4 ml，摇匀放置15min，在510nm处测吸光度值。以芦丁浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，然后绘制标准曲线。

精密吸取样品溶液1.0 ml于10 ml比色管中，各加80%乙醇至5 ml，加5%NaNO2溶液0.5 ml，摇匀放置6 min，再加10%Al(NO3)溶液0.5 ml，摇匀放置6min，加入4%NaOH溶液4 ml，摇匀放置15min，在510nm处测吸光度值。根据测得的吸光度值，按回归方程计算样品黄酮含量。

2.3.2 NZEt总酚含量的测定[12]：以没食子酸作标准曲线，精密称取0.070g的干燥没食子酸标准品，用蒸馏水溶解，定容于100 ml容量瓶中，摇匀,取5 ml放置50 ml棕色容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀即得没食子酸对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0分别置25 ml棕色容量瓶中，加10 ml蒸馏水，再依次加入FoLin试剂1 ml，7.5%Na2CO3溶液8 ml，蒸馏水稀释至刻度，充分摇匀混合后，放置1h，以相应的试剂为空白调零，在760nm处测吸光度。以没食子酸浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

精密吸取样品溶液1.0 ml于25 ml棕色容量瓶中，同样的加10 ml蒸馏水，再依次加入FoLin试剂1 ml，7.5%Na2CO3溶液8 ml，蒸馏水稀释至刻度，充分摇匀混合后，放置1 h，以相应的试剂为空白调零，在760nm处测定吸光度。根据测得的吸光度值，按回归方程计算样品总酚含量。

2.4 NZEt抗炎、止咳、祛痰作用研究

2.4.1 给药剂量的确定：根据成年人每日摄食牛至草人体推荐量为约9g(生药)，再按动物与人体的每公斤体质量剂量折算系数表，确定小鼠每日用量，即牛至草醇提取物实验动物小鼠给药剂量确定为高剂量为5.4 g/kg、中剂量为2.7 g/kg、低剂量为剂量1.35 g/kg。

2.4.2 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响(抗炎实验)：参照文献[13]，取小鼠50只，随机分为5组，即空白对照组(0.9%生理盐水)、阳性对照组(急支糖浆5.0 ml/kg)、NZEt高、中、低剂量组(5.4 g/kg、2.7 g/kg、1.35 g/kg)；适应性饲养3d后，灌胃给药1次/d，连续7 d。末次给药30 min后，于小鼠右耳两侧均匀涂抹二甲苯30μl致炎，左耳不涂作为对照。致炎1 h后颈椎脱臼处死小鼠，沿耳廓基线剪下两耳，使用直径为8 mm的打孔器摘取双耳对称耳片，精密称取。耳片质量以左右耳片重量差为肿胀度，并计算肿胀抑制率。以此判断牛至草醇提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响。肿胀抑制率(%)=(空白对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/空白对照组平均肿胀度×100%。

2.4.3 对浓氨水致小鼠咳嗽反应的影响(止咳作用) ：取小鼠50只，随机分为5组，即空白对照组(生理盐水)、阳性对照组(急支糖浆5.0 ml/kg)、NZEt高、中、低剂量组(5.4 g/kg、2.7 g/kg、1.35 g/kg)；适应性饲养3d后，灌胃给药1次/d，连续7d。给药体积均为0.02 ml/g，末次给药1h，将小鼠逐一放入2.5L密闭干燥容器内，恒压喷入25%浓氨水气雾，喷雾5s引咳，观察并记录其咳嗽潜伏期及2min内咳嗽次数。

2.4.4 对小鼠气管段酚红排泌量的影响(祛痰作用) ，取小鼠50只，随机分为5组，即空白对照组(0.9%生理盐水)、阳性对照组(急支糖浆5.0 ml/kg)、NZEt高、中、低剂量组(5.4、2.7、1.35 g/kg)；适应性饲养3d后，灌胃给药1次/d，连续7d。体积0.02 ml/g末次给药后30min，每只小鼠腹腔注射5%酚红生理盐水溶液0.2ml/20g体重，30min后处死小鼠，仰卧固定，颈部拉直，剥离周围结缔组织暴露气管，解剖分离出自甲状软骨下至气管分叉处的一段气管，将各气管段放入预先盛有2 ml 5% NaHCO3溶液的试管中，超声波清洗15min,使气管酚红完全释放，1000r/min 15min离心,取上清液，于分光光度计560nm处测定OD值，与酚红标准曲线比较，折算成酚红含量。

2.5 统计学方法:使用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计学处理，实验数据以均数±标准差表示。采用单因素方差分析，以P<0.05位差异具有统计学意义。体外抗氧化实验数据以均数和标准差表示，由Excel生成图标。

结 果

1 NZEt的体外抗氧化活性

1.1 对DPPH·自由基的清除作用：见图1。随着NZEt浓度的升高，其清除能力就越高，呈上升趋势，各浓度组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。其浓度为2mg/ml时清除率高达61.37%，接近于相同浓度的阳性对照药VC清除率62.0%。

图1 NZEt的DPPH·自由基清除能力测定

1.2 还原能力：见图2。随着NZEt浓度的升高，其吸光度也一同升高，说明NZEt还原能力也逐渐增强，但其最高浓度时的吸光度(1.82)仍低于最低浓度时的阳性对照药VC(2.93)，说明其还原能力小于阳性对照VC。

1.3 对·OH自由基的清除作用：见图3。NZEt清除羟基自由基能力同样随着醇提物浓度的升高呈增高趋势，其中浓度为2.0mg/ml的清除效果较高，清除率为41.3%，仍低于浓度为0.1mg/ml的VC清除率(53.4%)。

图2 NZEt的还原能力测定

图3 NZEt的羟基自由基清除能力测定

2 NZEt 总多酚、总黄酮含量 根据2.3.1的方法，以芦丁浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程A=0.2519C-0.0009，r2=0.9999，芦丁吸光度(A)和浓度(C)在20μg/ml～100μg/ml范围内线性良好。根据2.3.2的方法，以没食子酸浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程A=0.0627C+0.0376，r2=0.999，没食子酸吸光度(A)和浓度(C)在2.8gμg/ml～11.2μg/ml范围内线性良好。按上述回归方程，计算NZEt总多酚和总黄酮含量。结果表明，其总多酚含量高达32.64mg没食子酸/g，总黄酮含量为46.92mg芦丁/g。

3 NZEt的抗炎、止咳、化痰作用 结果可见，与空白对照组比较，阳性对照组及NZEt三个剂量组肿胀度、咳嗽潜伏期、咳嗽次数及酚红含量的差异均有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组比较，高、中、低剂量组肿胀度差异无统计学意义(P>0.05)。高剂量组咳嗽潜伏期差异有统计学意义(P<0.05)，而中、低剂量组无统计学意义(P>0.05)，高剂量组咳嗽次数差异有统计学意义(P<0.05)，而中、低剂量组无显著性差异(P>0.05)。高、中剂量组酚红含量增多，差异具有显著性(P<0.05)，而低剂量酚红含量低于阳性对照组。各剂量组间比较，酚红含量的差异具有显著性。说明牛NZEt具有较显著的抗炎、止咳、祛痰作用，具体见表1。

表1 牛至草醇提物抗炎、止咳、祛痰作用(

表1 牛至草醇提物抗炎、止咳、祛痰作用(

组 别剂量(g/kg) 抗炎耳肿胀度(mg)抑制率(%) 止咳咳嗽潜伏期(s)咳嗽次数 祛痰酚红含量空白对照组— 7．3±2．4— 33．80±10．4636．80±13．42 1．32±0．19阳性对照组5．0 3．8±1．3∗48．24 47．45±21．28∗15．30±7．33∗ 4．41±1．01∗低剂量组5．4 3．7±1．7∗50．41 40．88±13．3725．80±9．53∗ 2．64±0．68∗#中剂量组2．7 3．3±1．7∗56．08 50．17±16．46∗19．89±12．37∗ 3．44±1．12∗#Δ高剂量组1．35 4．1±2．3∗60．54 72．54±19．48∗#Δ14．40±9．78∗Δ 5．53±0．62∗#Δ

注：以空白对照相比，*P<0.05；与阳性对照比，#P<0.05；与各剂量组间比较，ΔP<0.05

讨 论

牛至草为维吾尔医习用药材，在维吾尔医临床和民间以其醇提物或水煎液用于治疗咳喘、感冒、支气管炎等异常黏液质性疾病治疗，疗效显著。它也是一种天然芳香植物之一，因其挥发油具有显著的杀菌和抑菌作用，多应用于饲料添加剂和食品防腐剂，国内外相关药理活性研究主要集中于其挥发油类成分。其挥发油的含量仅占药材的很少一部份，这样的使用状况既浪费了药材资源，也不能使药效得到全面发挥。因此，本研究将牛至草95%乙醇提取物为研究对象，采用DPPH· 、羟基自由基清除能力、还原能力及检测方法考察其的抗氧化作用，并对其总黄酮、总多酚含量进行测定；通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验、氨水致咳试验及气管酚红排泌试验，探讨其抗炎、止咳、祛痰作用，旨在为牛至草的临床应用和进一步研究提供参考。

当机体内氧化平衡紊乱时，产生的DPPH·、·OH等无法及时清除，造成其蓄积，过量的自由基将会导致细胞凋亡或坏死。体内蓄积的自由基与诸多疾病的发生和发展密切相关。本研究体外抗氧化实验结果表明，NZEt具有一定的抗氧化活性，其清除DPPH·、·OH及铁离子还原能力均随着浓度的升高而增强趋势，其中NZEt最高浓度(2mg/ml)时清除DPPH·能力接近于相同浓度的VC，而其清除·OH能力、还原能力均小于相同浓度的VC。

黄酮、多酚是植物的二次代谢产物，也是许多植物的活性成分或药效物质基础。NZEt中总黄酮和多酚含量分别高达46.92mg/g、32.64mg/g，可能是其发挥抗氧化作用的物质基础，但其具体抗氧化有效成分及作用机理等有待进一步研究。

慢性支气管炎等临床呼吸系统常见病及多发病，主要表现在咳、痰、喘症状，对其治疗应达到抗炎、镇

咳、祛痰等目的。本研究 NZEt 的抗炎、止咳、祛痰作用实验结果表明，与空白对照组比较，NZEt 三个剂量组肿胀度、咳嗽次数及酚红含量的差异均有统计学意义(P<0.05)，NZEt高剂量组的抗炎、止咳、祛痰作用优于阳性对照组，说明NZEt具有较显著的抗炎、止咳、祛痰作用。NZEt 的抗炎、止咳、祛痰作用，不仅为其临床应用及治疗物质基础提供了理论依据。至于其有效成分以及药理作用的确定有待今后进一步研究。

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