GNA11基因多态性与特发性甲状旁腺功能减退症及其并发症的关联

全婷婷，聂 敏，王亚冰，姜 艳，李 梅，夏维波，王 鸥，邢小平

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 内分泌科 国家卫生和计划生育委员会内分泌重点实验室， 北京 100730)

特发性甲状旁腺功能减退症(idiopathic hypoparathyroidism，IHP)是一种以低钙血症、高磷血症时甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)降低或在不适当正常范围内为主要生化改变的罕见疾病，其病因或发病机制目前尚未明确。临床上患者除有低钙血症相关表现如感觉异常、手足搐搦等外，部分还可出现颅内钙化、白内障、治疗相关性高钙尿症、泌尿系钙质沉着或结石等慢性并发症。目前有少数研究发现部分甲旁减相关基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)可能与IHP发病机制、临床特点及病情程度有关[1- 2]。

近年来新发现GNA11基因激活性突变导致编码的G蛋白α亚基11(G-protein subunit-α 11，Gα11)功能活跃，此蛋白为钙敏感受体(calcium-sensing receptor，CaSR)下游信号通路的重要蛋白伴侣，最终引起一种临床表现类似常染色体显性遗传低钙血症(autosomal dominant hypocalcemia，ADH)的疾病，被命名为2型ADH[3- 5]。为探索GNA11基因多态性与IHP疾病及其慢性并发症发生的相关性，本研究首次比较了GNA11基因标签SNP(TaqSNPs)的各基因型及单体型在IHP患者与正常对照间的分布特点，并探索了上述基因型及单体型与其临床表型多样性的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

病例组来自1987年12月至2015年12月于北京协和医院内分泌科门诊就诊的成年起病甲旁减患者共203例(男性81例，女性122例)，并排除有以下病史者：1)甲旁减家族史；2)合并Addison病、1型糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病、念珠菌感染等免疫性疾病；3)合并先天性心脏病、颜面畸形、肾脏异常、听力下降等先天发育异常；4)颈部手术或放疗史。同时纳入来自北京协和医院健康体检中心的年龄及性别匹配的健康人群共209名(男性103名，女性106名)作为对照组，排除肝肾功能不全、消化不良或胃肠手术史、恶性肿瘤、自身免疫性疾病及有影响钙磷代谢的药物使用史者。本研究经北京协和医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集：记录所有研究对象的性别、年龄、体质指数以及病例组的起病年龄、病程，通过头颅CT平扫、眼科裂隙灯和泌尿系超声检查记录IHP患者颅内钙化、低钙性白内障、泌尿系统钙质沉着或结石的发生情况。

1.2.2 实验室检查：血清总钙、磷、碱性磷酸酶和肌酐：分别采用偶氮砷Ⅲ法、磷钼酸法和酶法，由全自动生化分析仪测定。24 h尿钙：与血清总钙测定方法相同。血清PTH：1984年4月至1992年9月采用放射免疫法测定氨基端PTH[正常值(21.4±7.7) ng/L]；1992年10月至1998年7月采用放射免疫法测定中间段PTH(正常值60～450 ng/L)；1998年以后采用化学发光法测定全段PTH，正常值为(12～65) pg/mL。有8例患者于1998年7月前就诊，但因PTH测定方法不同，未纳入PTH水平的统计描述中。

1.2.3 SNP的挑选及分型

1.2.3.1 标签SNP(TaqSNP)挑选：在NCBI附属网站http://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snptag.html中进行查找：1)在中国汉族人群的GNA11基因序列中选取；2)最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)>0.05；(3)r2>0.8。最终选取了10个SNP，自5′至3′方向，依次为rs308039、rs1104737、rs17828831、rs308033、rs2238625、rs308060、rs385443、rs3786947、rs3746069和rs308049。

1.2.3.2 SNP的分型：采用OMEGA Blood DNA Midi Kit试剂盒提取所有研究对象的基因组DNA，由博淼生物科技(北京)有限公司通过Sequenom MassArray iPLEX分型平台进行SNP分型[6]，同时随机选取10%样本，应用Sanger测序分别验证上述位点的分型结果，提示两种分型方法一致性为100%。

1.3 统计学分析

计数资料以样本量(百分率)表示，采用卡方检验、Fisher精确检验进行比较。计量资料用均数±标准差或中位数M(P25，P75)表示，采用成组t检验或非参数检验进行比较。采用卡方检验各SNP位点基因型频率是否符合Hardy-Weinberg平衡。使用Haploview 4.2软件进行连锁不平衡结构域及单倍体的推断，以phase 2.0软件对每例个体进行单倍体分型。将各基因型分别在加性模型(A1A1vsA1A2vsA2A2，A1指常见等位基因，A2指少见等位基因)中以0、1、2赋值，显性(A1A1vsA1A2+A2A2)及隐性模型(A1A1 +A1A2vsA2A2)以0、1赋值后，对各病例、对照组进行二分类逻辑回归分析。单体型分析方法结果同上，其中0代表携带0条该单体型，1代表携带1条该单体型，2代表携带2条该单体型。在给予钙剂与维生素D制剂治疗后IHP患者中，以尿钙水平为因变量进行多元线性回归分析(经年龄、性别、治疗后血钙及血磷水平校正，上述自变量经单变量分析明确与尿钙排泄相关)。

2 结果

2.1 临床资料及实验室检查

IHP患者起病年龄四分位数间距为24～38岁，首次就诊时均有显著的低钙血症(1.63±0.31)mmol/L、高磷血症(1.90±0.39)mmol/L，且同步PTH水平为3.0 (3.0, 56.6)pg/mL。与之相比，正常对照组除血钙、血磷及碱性磷酸酶水平外，性别、年龄、BMI未见统计学上的显著差异(表1)。

2.2 GNA11基因各位点基本信息、分型及单倍体分型结果

筛选所得的10个SNP位点，分型成功率均大于98%。除rs2238625外，余位点在病例组及对照组中的等位基因频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)(表2)，遂在后续分析中剔除rs2238625。以Haploview进行单倍体分型，各位点自5′至3′排列，结果提示rs308033、rs308060、rs385443、rs3786947、rs3746069和rs308049存在高度的连锁不平衡(D′> 90)，以此建立单倍体，共获得9种可能单体型，其中5种常见单体型(单体型频率>0.1)可以解释全部个体中92.5%的单体型分布(图1)。

2.3 GNA11各位点基因型、单体型与IHP发病风险的相关性

rs308060的基因型在加性模型[TCvsCC，OR=2.505(1.005～6.245)，P<0.05；TTvsCC，OR=3.269(1.264～8.458)，P<0.05]、隐性模型[TTvsCC+ TC，OR=2.727(1.105～6.727)，P<0.05]中可增加IHP发病风险。同样，单体型2(即TTCGCC)在加性模型[OR=2.726(1.036～7.178)，P<0.05；OR=3.321(1.215～9.076)，P<0.05]、隐性模型[OR=2.895(1.109～7.553)，P<0.05]中均与IHP发病风险相关，此单体型为IHP的致病因素，且致病性随着携带单体型数目的增加而增加(表3)。

表1 病例、对照组的人口学特点及生化指标Table 1 Anthropometric and clinical characteristics of the cases and controls

aChi-square test;bStudent’s test;cMann-Whitney U test；*8 patients, who were diagnosed with hypoparathyroidism before July 1998, were excluded in the statistical description because of the different testing methods of PTH level.

表2 GNA11基因各TaqSNP的基本信息Table 2 TaqSNPs information of GNA11 gene

SNP.single nucleotide polymorphisms; HWE.hardy-weinberg equilibrium.

A.LD blocks and correlation coefficients among GNA11 SNPs in haploview; B.haplotype frequencies of GNA11 polymorphisms图1 GNA11基因SNP组成各单体型的分析Fig 1 Analysis of the haplotypes consisted of different SNPs in GNA11 gene

2.4 SNP位点基因型及单体型与IHP慢性并发症的关系

2.4.1 各位点基因型间、常见单体型数目组间颅内钙化及白内障发生率的比较：共146例进行头颅CT平扫检查，发现颅内钙化者91例(62.3%)；68例进行了眼科裂隙灯检查，发现白内障者51例(75.0%)。根据是否携带各位点的少见基因或某种单倍体型，将上述患者分为两组(携带与未携带者)，进行各位点、单体型颅内钙化及白内障发生率的比较，未观察到有显著性差异(表4)。

表3 GNA11基因SNP的基因型、单体型与特发性甲旁减发病风险的相关性分析(病例-对照研究)Table 3 The association of GNA11 genotypes and haplotypes with IHP risk in case-control groups

Haplotype 1～5 for haplotype CCGGTC,TTCGCC,CCCGCC,CCCACC and CCGGCT, respectively; genotypes and haplotypes were assigned codes of 0, 1 and 2 in the additive model, 0, 1 and 1 in the dominant model, and 0, 0 and 1 in the recessive model, according to the number of minor allele or copies of haplotype;*subjects without minor alleles or copies of haplotype are the reference.

表4 携带与未携带少见基因或单体型的特发甲旁减患者颅内钙化及白内障发生率的比较

续表4

SNPIDmodelaintracranialcalcification,N(%)POR(95%CI)cataract,N(%)POR(95%CI)rs308033052/85(61.2)0.7341.125(0.570,2.222)31/40(77.5)0.5690.726(0.240,2.193)139/61(63.9)20/28(71.4)rs308060054/89(60.7)0.5231.260(0.620,2.563)29/38(76.3)0.7000.798(0.253,2.519)135/53(66.0)18/25(72.0)rs385443030/48(62.5)0.9400.973(0.477,1.986)18/23(78.3)0.6210.741(0.225,2.441)160/107(61.9)32/44(72.7)rs3786947062/104(59.6)0.2491.581(0.723,3.453)33/46(71.7)0.4211.674(0.473,5.927)128/40(70.0)17/21(81.0)rs3746069050/82(61.0)0.7031.141(0.580,2.244)28/38(73.7)0.7781.173(0.386,3.569)141/64(64.1)23/30(76.7)rs308049065/105(61.9)0.6711.183(0.544,2.575)38/50(76.0)0.5640.695(0.201,2.402)125/38(65.8)11/16(68.8)Haplotype1050/82(61.0)0.7031.141(0.580,2.244)27/37(73.0)0.6731.270(0.418,3.859)141/64(64.1)24/31(77.4)Haplotype2056/93(60.2)0.4851.285(0.635,2.597)33/43(76.7)0.6630.779(0.253,2.397)135/43(66.0)18/25(72.0)Haplotype3061/94(64.9)0.3900.738(0.368,1.477)33/43(76.7)0.6630.779(0.253,2.397)130/52(57.7)18/25(72.0)Haplotype4063/105(60.0)0.3531.436(0.668,3.086)34/47(72.3)0.4491.625(0.460,5.745)128/41(68.3)17/21(81.0)Haplotype5066/107(61.7)0.7891.109(0.518,2.376)40/52(76.9)0.5090.660(0.191,2.277)125/39(64.1)11/16(68.8)

a0: patients without minor alleles or haplotypes; 1.patients with one or more minor alleles or haplotype;bnumber of patients who received cranial CT scan;cnumber of patients who received slit lamp examination.

2.4.2 IHP患者治疗后尿钙水平在各位点基因型间、常见单体型数目组间的比较：所有IHP患者在给予钙剂及维生素D制剂(如普通维生素D、活性维生素D)治疗后，血钙、血磷水平较前改善的同时，每日尿钙排泄水平随之升高，部分患者出现高钙尿症。为探索GNA11各位点是否与患者治疗尿钙水平相关，在校正年龄、性别、血钙及血磷后，多元线性回归分析结果显示IHP患者治疗后24 h尿钙排泄与单体型5(即CTCGCT)的显性模型相关(β=0.186，P<0.05)，携带单体型CTCGCT的数目越多，尿钙排泄水平越高(表5)。但在长期的随诊过程中，仅有4例患者出现泌尿系钙质沉着或结石，因此无法进一步研究SNP位点的基因型及单体型是否与之发生有关。

3 讨论

特发甲旁减的发病机制目前尚未明确，有关基因多态性与其发病风险的相关研究接受钙剂亦较为有限。GNA11基因的胚系激活性突突变可引起Gα11功能异常，使钙敏感受体信号通路持续激活，细胞外液钙离子浓度-甲状旁腺激素浓度的反应曲线左移，抑制PTH的合成及分泌，影响钙稳态的维持，从而导致2型常染色体显性遗传低钙血症，成为遗传性甲旁减的主要病因之一[4, 7- 9]。本研究观察到，GNA11基因rs308060的少见等位基因T可能会增加IHP的发病风险，同时包括其在内的单体型TTCGCC亦与IHP发病风险有关，携带此单体型数目越多，发病风险越高。因此提示基因多态性可能与特发甲旁减的易感性有关，为特发甲旁减发病机制的研究提供了一个新的方向。

表5 GNA11基因SNP基因型、单体型与IHP患者及维生素D制剂治疗后尿钙排泄的关系

Linear regression analysis of three models(additive, dominant and recessive), adjusted for age, gender, serum calcium and phospharus level.

IHP患者的颅内钙化、白内障、高钙尿症及泌尿系钙质沉着/结石等慢性并发症的发生率因人而异，具体原因尚不清楚。以颅内钙化为例，有报道颅内钙化的发生与钙磷乘积有关[10]。此外，基底节表达的PTH1受体、PTH2受体、碳酸酐酶II、PTH依赖性钠-磷转运体等分子亦可能与颅内钙化有关[11- 14]。国外研究分析过PTH基因多态性与颅内钙化发生的关系，但并未发现有阳性结果[2]。因此，本研究探索了上述慢性并发症发生率的差异与GNA11基因多态性的关系，但结果并未发现两者具有相关性。

2型常染色体显性遗传低钙血症患者远端肾小管对尿钙的重吸收作用减弱，因此在给予钙剂及维生素D制剂治疗后容易出现高钙尿症[15]。本研究发现，由rs308060少见基因T组成的单体型CTCGCT与尿钙排泄水平相关，携带此单体型的数目越多，24 h尿钙水平越高，进而表明不仅是GNA11基因发生激活性突变会导致治疗相关性高钙尿症，其基因多态性亦可能会影响高钙尿症的风险。携带这些基因多态性位点少见基因的患者需在随诊过程中密切监测血钙、血磷、24 h尿钙磷、肾功能及泌尿系统影像学检查，及时调整钙剂及维生素D制剂的剂量以避免出现高钙尿症，从而减少泌尿系钙质沉着或结石、肾功能受损等肾脏并发症的发生。

综上所述，本研究首次通过基因型、单体型的关联分析发现GNA11基因的rs308060位点少见基因T可能会增加特发甲旁减的发病风险，并且与患者接受钙剂及维生素D制剂治疗后的尿钙排泄水平呈正相关，为甲旁减患者治疗目标的制定及监测提供了参考。

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