组织工程骨膜技术及其在治疗骨缺损中的应用

肖正俊，阿良*，李洪秋，邓纯博，沈晓桐

（1.沈阳医学院附属中心医院骨外科，辽宁 沈阳 110024；2.妇产科）

外伤、感染、肿瘤等疾病所导致的骨缺损填充和重建对骨移植材料有非常大的需求，显示了骨移植庞大的应用市场。现有骨缺损的治疗方法主要有三种：（1）自体骨移植、同种异体骨移植和异种骨移植；（2）骨延长术；（3）诱导膜技术。三者不是取自体骨或异体骨，就是二次手术且手术周期长，给患者身心带来巨大伤害［1］。近年来，组织工程骨膜技术研究发展迅速，具有广阔的应用前景，现予以综述。

1 组织工程骨膜技术

1.1 骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymal stem cells，BMSCs） BMSCs起源于中胚层，存在于全身结缔组织和器官间质中，其中以骨髓中含量最为丰富，是骨髓中非造血干细胞，能够支持体外造血和促进体内造血功能重建，具有自我复制和多向分化潜能［2］，在一定的诱导条件下能够分化为成骨细胞、软骨细胞等成熟细胞，易于提取和培养，且免疫原性低［3-4］。

1.2 人脱细胞羊膜（human acellular amniotic membrane，HAAM） 有研究证实，羊膜本身就是一种良好的生物材料［5］。HAAM以健康足月孕妇羊膜为基础原料，75%乙醇进行病毒灭活，使用0.25%胰蛋白酶脱细胞处理，配置碳二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺（4：1）体系进行交联改性，之后无菌条件下采用生理盐水清洗，完全洗去残留试剂，仅保留了基膜层和致密层，有效地去除了羊膜中的细胞成分，保留了纤维网状结构，进一步降低了抗原性［6］。羊膜脱细胞材料属于可吸收胶原类材料，能够作为种子细胞和材料支架应用于组织工程骨膜中，为骨缺损的修复带来了希望［7］。

1.3 组织工程骨膜（tissue engineering periosteum）

组织工程骨膜基于生命科学与工程学的原理，选取BMSCs作为定向分化成骨细胞的种子，HAAM作为BMSCs附着、增殖和分化的可降解的支架材料，复合细胞生长调节因子而成。组织工程骨膜结合了两者的优点，不改变细胞相容性和HAAM原本的特性，并能够在一定程度上保护细胞的生长，从而产生骨膜的结构和功能，其置于骨缺损区域可诱导成骨的生长［6］。组织工程骨膜既有良好的生物相容性、组织学和理化特性，又有生物降解性、透明性等优点，作为组织工程骨膜支架材料有其独特的优越性［8］。

2 组织工程骨膜分类

2.1 宏观组织工程骨膜（bionic macrostructure tissue-engineering periosteum） 在生物膜上培养细胞是制造组织工程骨膜最简单的方法，可以容易地模仿骨膜的粗糙结构。在体外，BMSCs负载于生物膜上黏附和增殖良好，已经合成了骨膜样材料。而且受骨形态发生蛋白（BMP）刺激的影响，骨膜样材料中的成骨细胞显示潜在的生长差异。在体内，通过BMSCs接种在人脱细胞真皮上用于骨缺损治疗，6～8周骨缺损成功愈合，表明通过在膜的表面上培养细胞，例如人脱细胞真皮携带BMSCs和骨诱导蛋白可以制造组织工程骨膜［9］。

同种异体骨移植中不存在骨膜及其干细胞群体，影响骨缺损愈合。Hoffman等［10-11］使用可降解的水凝胶作为BMSCs支架，并将其与干细胞移植到同种异体移植物表面上，可导致移植物血管化增强及软骨内骨形成增多，再添加额外骨祖细胞用于共系培养，可预防骨化延迟，达到组织工程化“拟生态骨膜”，增强骨缺损治疗效果。

静电纺丝技术（简称“电纺”）是一种在高压电场作用下形成超细纤维的聚合物加工技术，通过控制电纺过程的各种参数可以制成性能不同的纳米纤维支架。电纺纳米纤维也是组织工程骨膜制造的有吸引力的基础。含地塞米松（DEX）的聚乙烯醇（PVA）纳米纤维合成具有控制释放特性的人工骨膜，培养3周后，通过DEX诱导干细胞分化为成骨细胞，具有高表达的骨基因和蛋白质［12］。因此，电纺纳米纤维被认为是满足基本要求的人造骨膜。

由法国医师 Masquelet等［13］提出的诱导膜（IM）技术也已经用于组织工程骨膜，对35例长骨缺损患者清创后，将骨缺损部位填入骨水泥（聚甲基丙烯酸甲酯，PMMA），在其周围诱导生物膜形成，6～8周后去除骨水泥，将颗粒状自体松质骨填充骨缺损部位并固定，取得良好治疗效果。Cuthbert等［14］用IM技术治疗临界尺寸骨缺损患者，并与健康股骨干骨膜比较分析，结果发现IM诱导的骨膜厚度显著增加，淋巴细胞、周细胞的数目显著提高，可表达骨形态发生蛋白-2、血管内皮生长因子（VEGF）和基质细胞衍生因子（SDF-1）等关键组织再生因子，并且IM诱导细胞表达的SDF-1转录物表达量是健康骨膜细胞的2倍。IM被认为是体内合成的组织工程骨膜，是组织工程骨膜的一个典型例子。

2.2 微观组织工程骨膜（bionic microstructure tissue-engineering periosteum） 虽然相关研究显示宏观组织工程骨膜增强了骨再生，但是与天然骨膜的表面形态和微结构存在明显的差异，这可能降低治疗效果。为了无限接近天然骨膜的微结构，实验证明直接使用无细胞骨膜，使大鼠的颅盖缺损恢复良好，显示骨膜微结构的重要性［15］。为了更好地显示微观组织工程骨膜的意义，Shi等［15］在聚乳酸-共-乙醇酸（PLGA）纳米片上产生了微槽结构，可指导细胞优选沿着微槽结构方向传播，以调节干细胞的空间取向并应用不同的机械拉伸作用促进成骨细胞生长，在骨生长和重建中起着重要作用。可见，我们应该更加重视微观组织工程骨膜，进一步的探索。

2.3 血管化组织工程骨膜（vascularized tissueengineered periosteum） 在天然骨膜中血管组织丰富，血管生成在骨发育和骨折修复中有重要作用，可以为骨膜提供氧气和营养成分。诱导组织工程骨膜中血管化是一个亟待解决的问题。van Gastel等［16］研究了小鼠骨膜来源细胞（periosteum derived cells，PDCs）的致血管生成特性，发现PDCs能表达并分泌VEGF，从而增强内皮细胞的增殖和存活；与内皮细胞共移植发现，PDCs可通过调节内皮细胞形成周细胞样表型来增强血管发生。VEGF和VEGFR主要参与血管生成，Hah等［17］对人PDCs细胞的成骨细胞分化过程进行研究，发现VEGF、血管内皮生长因子受体VEGFR-1、VEGF-2的表达，而外源性人VEGF可刺激PDCs的成骨细胞分化过程，并且VEGF可充当人PDCs的成骨细胞分化的自分泌生长因子。这些结果研究表明，骨膜细胞不仅通过其成骨潜能，而且还通过其促血管生成的特点，有助于骨折修复，从而为骨再生治疗提供理想的细胞来源。

3 组织工程骨膜治疗骨缺损

目前，虽然没有应用于临床上的大段骨缺损的治疗，但是治疗小面积骨缺损时有报道。Nagata等［18］将培养的自体骨膜细胞（CAPCs）、自体骨颗粒和富含血小板的血浆混合，并移植修复唇腭裂患者的牙槽骨，术后显示骨再生良好，骨活检显示再生骨周围聚集成骨细胞和破骨细胞并伴随血管生成，并且CAPCs骨移植的自体骨颗粒的重建速度明显快于常规植骨。Pradel等［19］比较组织工程骨和自体松质骨治疗腭裂患者的疗效差别，术后6个月随访发现，组织工程骨移植组的裂口平均体积低于自体松质骨移植组，而组织工程移植组的腭裂缺陷骨化率（40.9%）明显高于自体松质骨移植组（36.6%）。

一直以来大家都认为关节软骨损伤（或缺损）为不可逆修复，伴随着组织工程骨膜修复关节软骨损伤（或缺损）技术［20］的问世，彻底打破这一定论。Oehi等［21］将体外分离的自体软骨细胞接种到胶原蛋白凝胶中，培养21～26 d后移植到软骨缺损处，治疗后可减低患者的疼痛和肿胀，1年后随访发现，患者疼痛消失，移植处形成透明坚固表面光滑的关节软骨，且再生软骨的硬度与周围正常软骨一致，结果表明通过组织工程制造的软骨样组织的移植有望成为长时间获得软骨的最有效的技术，其在缺陷处产生的软骨与正常软骨有相似的生物化学和生物力学特性。另一种软骨缺陷修复方法是基质诱导的自体软骨细胞移植技术，即体外培养的自体软骨细胞接种到Ⅰ/Ⅲ型胶原膜上，将纤维蛋白注射到缺陷处软骨表面用以固定胶原膜，胶原膜修剪后移植到软骨缺损处，使关节软骨再生，临床疗效已经得到了证实［22］。

综上所述，组织工程骨膜技术应用于骨缺损治疗，特别是关节软骨损伤的治疗，具有较好的临床效果。但是，组织工程骨膜技术治疗骨缺损仍存在一定的争议。一些学者持怀疑态度，他们认为HAAM虽是可降解和吸收材料，但是采取异体间植入骨缺损处是否会产生伦理问题有待商榷。支持者则认为这是医学研究的进步，为患者康复带来希望。目前，组织工程骨膜在相关动物实验中已经得到十足发展，为其将来的临床应用奠定基础。然而，人工骨膜如何能无限接近天然骨膜，从而满足骨缺损的临床需求，如何解决移植物的免疫调节等问题仍有待深入研究。

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