原花青素对尿路致病性大肠杆菌黏附、侵袭膀胱上皮细胞的影响及其机制

沙凯辉，刘同刚，张晓丽

(1 滨州医学院，山东滨州 256600；2 滨州医学院附属医院)

尿路感染是一种常见反复发作的感染性疾病。尿路致病性大肠杆菌(UPEC)是健康成年人尿路感染的主要侵入性病原体[1～3]。细胞骨架微丝的主要成分为球状肌动蛋白，在多种因素作用下可聚合成纤维状肌动蛋白(F-Actin)[4～6]。这一肌动蛋白的动力学改变可引起细胞骨架重排，驱动细胞质膜扩展、形变等，以便于UPEC等病原菌侵袭膀胱上皮细胞。整合素是由α和β亚基组成的异源二聚体，是一种重要的跨膜受体，可调节胞外基质蛋白和肌动蛋白细胞骨架之间的相互作用。原花青素是一种复杂的黄酮类天然聚合物。已有研究证实，原花青素具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤的生物学活性[7～12]。2017年7月～2018年3月，本研究探讨原花青素对UPEC黏附、侵袭膀胱上皮细胞的影响及其机制，旨在为防治尿路感染提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人膀胱上皮细胞株T24(ATCC HTB-4)购自中国科学院上海细胞库，-150 ℃冰箱保存。UPEC J96(血清型O4：K6，ATCC 700336)购自ATCC，- 70 ℃冰箱保存。自冰箱内取出细菌，室温下缓慢溶解；取50 μL菌液接种于5 mL LB肉汤液体培养基中，37 ℃、170 r/min振荡培养过夜；用接菌环将细菌接种于TSA固体培养基中，37 ℃培养过夜形成单菌落，4 ℃冰箱保存备用，保存期约1周。

1.2 细胞培养与分组处理 自冰箱内取出T24细胞，37 ℃温水中快速溶解，转移至含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素RPMI 1640培养基的离心管中，1 000 r/min离心3 min，弃上清，更换新的培养基，轻轻吹打混匀。将细胞接种于培养皿中，于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。将T24细胞接种于24孔板中，每孔2.5×105个，置于细胞培养箱中过夜，随机分为空白对照组、阴性对照组和原花青素组，每组设3个复孔。阴性对照组和原花青素组分别加入等量DMSO和亚抑菌浓度的原花青素孵育40 min。

1.3 UPEC对T24细胞黏附能力的影响 采用平板菌落计数法。用细菌接种环从LB固体培养基上挑取单菌落并接种于5 mL LB液体培养基中，37 ℃、170 r/min摇床振荡过夜；取50 μL菌液加入5 mL LB液体培养基中继续摇床培养3 h，达到对数生长期；3 000 r/min离心3 min，弃去上清，收集细菌，加入一定量PBS重悬；紫外分光光度计检测625 nm波长处的光密度值为0.6时，细菌浓度为1×109CFU/mL；用无血清无双抗的RPMI 1640培养基按照100∶1的感染复数重悬细菌，振荡混匀，备用；将各组细胞用3倍体积的预温无菌PBS清洗，随后将重悬后的菌液接种于24孔板内，置于37 ℃孵箱中孵育，使细菌感染细胞；孵育2 h，以3倍体积的预温PBS清洗孔板，洗去未黏附细菌；每孔加入的0.25% TritonX-100溶液200 μL充分裂解细胞，反复吹打，收集至无菌EP管，每孔加入无菌PBS 800 μL清洗，同样收集至EP管，漩涡振荡混匀；以10倍稀释法梯度稀释10 000倍后，吸取100 μL细胞裂解液涂布于LB琼脂平板上。37 ℃恒温孵箱倒置培养，次日菌落计数。以空白对照组的黏附率为100%，计算阴性对照组和原花青素组相对黏附率。

1.4 UPEC对T24细胞侵袭能力的影响 感染2 h，每孔加入500 μL含100 μg/mL庆大霉素的RPMI 1640培养基，37 ℃孵育2 h以杀死胞外菌；以3倍体积的预温PBS清洗孔板，充分洗去庆大霉素；每孔加入的0.25% TritonX-100溶液200 μL充分裂解细胞，反复吹打，收集至无菌EP管，每孔加入无菌PBS 800 μL清洗，同样收集至EP管，漩涡振荡混匀；以10倍稀释法梯度稀释100倍后，吸取100 μL细胞裂解液涂布于LB琼脂平板上。37 ℃恒温孵箱倒置培养，次日菌落计数。以空白对照组的侵袭率为100%，计算阴性对照组和原花青素组相对侵袭率。

1.5 T24细胞表面整合素受体α3、β1 mRNA表达检测 采用RT-PCR法。提取总RNA：按照总RNA提取试剂盒说明提取各组细胞总RNA，置于-70 ℃保存备用。RNA逆转录合成cDNA：参照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行。实时荧光定量PCR：使用real-time PCR仪，参照Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2×)说明书将各反应试剂混匀后加入PCR管，短暂离心后置于PCR仪，设置好反应程序进行反应。Integrin α3正向引物：5′-AAGGGACCTTCAGGTGCA-3′，反向引物：5′-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3′；Integrin β1正向引物：5′-GAAGGGTTGCCCTCCAGA-3′，反向引物：5′-GCTTGAGCTTCTCTGCTGTT-3′；内参GAPDH正向引物：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，反向引物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.6 T24细胞F-Actin表达检测 采用流式细胞术。以预冷的PBS(1 mL/孔)清洗细胞3次；0.25%胰酶消化2 min；预冷的含10%血清培养基终止消化，收集至EP管，1 000～3 000 r/min离心3 min，弃上清；预冷的PBS清洗1次，离心弃上清；加入4%多聚甲醛500 μL混匀，室温静置15 min；PBS稀释离心弃上清，预冷的PBS清洗1次；加入0.1%曲拉通500 μL混匀，室温静置10～20 min；PBS稀释离心弃上清，预冷的PBS清洗1次；加入5 μg/mL罗丹明-鬼笔环肽160～180 μL振荡混匀，室温避光1 h；PBS稀释离心弃上清，预冷PBS清洗2次；400 μL PBS重悬，流式细胞仪检测各组细胞F-Actin的相对荧光强度。

2 结果

2.1 各组黏附率、侵袭率比较 空白对照组、阴性对照组、原花青素组相对黏附率分别为(100.00±0.00)%、(109.05±2.21)%、(82.91±3.35)%，相对侵袭率分别为(100.00±0.00)%、(111.43±8.70)%、(77.14±6.56)%。与阴性对照组和空白对照组比较，原花青素组相对黏附率、相对侵袭率均明显降低(P均<0.01)，而阴性对照组与空白对照组比较P均>0.05。

2.2 各组T24细胞表面整合素受体α3、β1 mRNA表达比较 空白对照组、阴性对照组、原花青素组T24细胞表面整合素受体α3 mRNA相对表达量分别为1.01±0.09、0.91±0.10、0.42±1.07，T24细胞表面整合素受体β1 mRNA相对表达量分别为3.41±0.12、3.55±0.23、1.07±0.26。与阴性对照组和空白对照组比较，原花青素组T24细胞表面整合素受体α3、β1 mRNA相对表达量均明显降低(P<0.01)，而阴性对照组与空白对照组比较P均>0.05。

2.3 各组F-Actin相对荧光强度比较 空白对照组、阴性对照组、原花青素组未经UPEC J96感染细胞的F-Actin相对荧光强度分别为24.95±1.06、25.40±0.72、22.43±0.87，经UPEC J96感染细胞的F-Actin相对荧光强度分别为30.13±2.97、32.40±3.56、24.33±1.00。与阴性对照组和空白对照组比较，原花青素组无论是UPEC J96未感染细胞还是UPEC J96感染细胞，F-Actin相对荧光强度均明显降低(P均<0.01)，而空白对照组与阴性对照组比较P均>0.05。

3 讨论

尿路感染是一种常见的感染性疾病，每年全世界有1.5亿人发生尿路感染，1 400万人因尿路感染而入院，估计每年用于卫生保健的总成本约60亿美元[2,13～15]。UPEC主要导致急性膀胱感染(膀胱炎)和肾感染(肾盂肾炎)，并可引起严重慢性肾功能衰竭或菌/败血症。尿道黏膜是病原微生物定植最为棘手的部位之一，黏附和侵袭是UPEC等尿路致病菌逃避宿主免疫反应和抗生素治疗最重要的策略，可促进病原体更有效地定植于尿道并引发感染[16]。本研究发现，原花青素预处理膀胱上皮T24细胞后，UPEC J96对膀胱上皮细胞的黏附和侵袭能力均明显降低。

在最为常见的膀胱感染中，最关键的一步即是UPEC等尿路致病菌利用其表达的Ⅰ型菌毛黏附素FimH与膀胱上皮细胞膜表面含有甘露糖残基的蛋白受体uroplakin Ⅰa及整合素α3/β1等结合[1,17]，进而激活多条细胞内信号级联，介导UPEC等病原菌侵袭进入膀胱上皮细胞。整合素是由α和β亚基组成的异源二聚体，是一种重要的跨膜受体，可调节胞外基质蛋白和肌动蛋白细胞骨架之间的相互作用[18～20]。UPEC UTI89可直接或间接通过基质蛋白与α3/β1整合素受体结合，进而侵袭宿主细胞[19]。本研究结果显示，原花青素可明显降低T24细胞整合素α3/β1表达，提示原花青素可能通过调节α3/β1整合素受体表达，继而减少UPEC黏附，从而通过下游信号通路抑制肌动蛋白聚合和UPEC侵袭。

真核细胞骨架主要由微丝、微管和中间纤维构成，其中微丝主要发挥支撑、非肌性运动和信息传导作用，微管则主要用于维持细胞形态及辅助细胞内运输[21]。众所周知，UPEC可改变宿主的信号级联活化并使宿主微丝肌动蛋白聚合重排，这是UPEC侵袭宿主细胞所必需的[22]。本研究发现，原花青素预处理T24细胞，可明显抑制骨架微丝肌动蛋白聚合，进而减少UPEC侵袭。因此，原花青素所致的UPEC侵袭减少可能依赖于Actin多聚态F-Actin表达降低。

综上所述，原花青素可通过抑制膀胱上皮细胞表面整合素受体表达，从而减少UPEC对膀胱上皮细胞黏附；通过抑制F-Actin表达，抑制UPEC侵袭膀胱上皮细胞。