伤科消痛酒微生物限度检查方法的适用性试验

钟柳芳 肖文可

伤科消痛酒为广州市番禺区中医院医院制剂的一种外用中药复方洗剂，其具有清热、散瘀止痛、活血消肿等功效。临床主要用于跌打诸证、风湿痛证等病证，该类中成药常具有消炎、抑菌及杀菌的作用。为了更加准确地体现出药品微生物的污染情况，需要采取实验来对药品的抑菌作用进行消除。本研究探讨伤科消痛酒对微生物限度检查方法的适应性进行试验，以便研究出基于伤科消痛酒进行微生物限度的检查方法，提高医院制剂的安全性，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器霉菌培养箱[上海跃进医疗器械厂生产，批准文号：沪食药监械（准）字2009第2411044号]；生化培养箱[上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产，批准文号：沪食药监械（准）字2011第2411164号]；电热恒温水浴箱（广东环凯微生物科技有限公司生产，型号：WBK-4A）；全自动电热压力蒸汽灭菌器（上海三申医疗设备公司生产，型号：YM302）；无菌检查仪（天津市罗根科技有限公司生产，型号：WJ-6）；快速混合仪（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂生产，型号：SZ-1）；生物安全柜（苏净集团苏册安泰空气技术有限公司生产，型号：BHC-1300ⅡA2）。

1.2 供试药品伤科消痛酒（广州市番禺区中医院制剂室提供，规格：20g/50ml）。

1.3 培养基广东环凯微生物科技有限公司提供本实验培养基，包括胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养、甘露醇氯化钠琼脂培养基等。

1.4 菌株菌株均为第三代，黑曲霉[Aspergillus niger，CMCC（F）98003，中国药品生物制品检定所提供]；铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌[P.Aeruginosa，CMCC（B）10104]、金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003]、白色念珠菌[Monilia albican 或 Canidia Albicans，CMCC（F）98001]及枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis，CMCC（B）63501]，上述四种菌株均由中国医学细菌保藏管理中心提供。

2 试验方法

2.1 菌液的制备根据2015年版《中华人民共和国药典》的相关规定及要求[1]，试验组和菌液对照组均采用溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，在胰酪大豆胨液体培养基中将铜绿假单胞菌的新鲜培养物接种到胰酪大豆胨液体培养基中，同时对金黄色葡萄球菌实施接种，放置环境条件为33 ℃，培养24 h；沙氏葡萄糖液体培养基接种白色念珠菌新鲜培养物；枯草芽孢杆菌新鲜培养物接种到胰酪大豆胨琼脂培养基中；0.9%无菌氯化钠溶液应用上述培养物中，配置菌悬液，含菌数≤100 cfu/ml的菌悬液。采用甘露醇氯化钠琼脂培养基培养黑曲霉新鲜培养物120 h，然后接种、孢子洗脱，采用5 ml含0.05%聚山梨酯80（大连广会科技有限公司，批准文号：国药准字H21021050，批号：86901256000021）的 0.9%无菌氯化钠溶液配置孢子悬液，无菌毛细吸管放置到无菌试管中以便配置孢子悬液，悬液孢子数控制在100cfu/ml以下。

2.2 供试液的制备将10 ml供试品加到pH为7的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液中，溶液体积为 100 ml，制作供试液。

2.3 菌株培养选用制备好的供试液1 ml，添加到pH为7的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml，然后将2.1项下制备的菌液1 ml加入其中，充分摇匀，以薄膜方式实施过滤，单次过滤均使用缓冲液 600 ml，分批次冲洗，最终取出滤膜，置于相应琼脂平皿中，按照《中华人民共和国药典》有关要求进行培养。需氧菌总数计数的试验菌株及真菌和酵母菌对应试验的培养基分别为胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基[2]，所有试验菌株需要操作2次。

2.4 金黄色葡萄球菌检查适用性试验取10 ml上述方法制备的供试液进行薄膜过滤，采用pH为7的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至 600 ml，单次冲洗液容量100 ml，冲洗5次，然后于第6次冲洗时加入含50～100 cfu的铜绿假单胞菌与金黄色葡萄球菌的混悬液1 ml，过滤，取出滤膜，在室温30～35 ℃条件下在培养基中接种胰酪大豆胨液体 100 ml，甘露醇氯化钠琼脂培养基平板中接种培养 24 h。溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板也需要进行相应接种，接种方式为划线接种，培养 18～72 h，最后对结果进行观察。

2.5 供试品对照组采取不加试验菌株的稀释液替代供试液，按照供试液的制备方法来进行操作。

2.6 计数方法适用性试验的回收率计算方法：试验组菌回收率比值=试验组菌落数/菌液对照组菌落数－供试品对照组菌落数/菌液对照组菌落数[3]，采用薄膜过滤法作为本次试验的计数方法。

3 结果

3.1 需氧菌总数计数适用性试验结果薄膜过滤法可使黑曲霉、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的回收率比值均高于 0.70以上，见表1。

表1 需氧菌总数计数适用性试验结果

3.2 真菌和酵母菌总数计数适用性试验结果薄膜过滤法可使真菌和酵母菌的回收率比值均高于0.70以上，见表2。

表2 真菌和酵母菌总数计数适用性试验结果

4 结论

伤科消痛酒属于中药复方洗剂，其常作为跌打损伤、风湿疼痛的外用疗法之一，具有较强的抗炎、杀菌、抑菌作用，方中大黄具有清热解毒、凉血祛湿的功效，对革兰阳性菌及部分革兰阴性菌具有较强的抑菌作用[4]，白酒具有散寒止痛的功效，消炎抑菌效果也较为明显[5]。而抑菌作用对微生物限度检查会产生一定的影响[6-7]。为保证检验质量，根据国家药典委员会、中国药品生物制品检定所相关规定[8-9]，对伤科消痛酒的微生物限度进行检查，并进行计数方法学验证、控制菌检查方法验证。薄膜过滤法常用于检测中药液体制剂，以消除药物的抑菌作用，使检查结果更具有效性。

本研究按照《中华人民共和国药典》2015年版规定，采用薄膜过滤法探讨伤科消痛酒微生物限度检查方法的适用性试验。结果显示，薄膜过滤法可使黑曲霉、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的回收率比值均高于 0.70；真菌和酵母菌总数计数适用性试验结果显示，薄膜过滤法可使真菌和酵母菌的回收率比值高于0.70；5种验证菌株的菌落数比值均在0.5～2.0，符合验证要求。上述结果表明，可以采用此种方法对伤科消痛酒进行微生物限度控制菌检查。

本研究采用直接稀释法来稀释本样品，反馈结果表明，3种试验菌株的回收率比全部在0.5以下，所以，联合薄膜过滤法的目的在于将供试品的抑菌活性消除。薄膜过滤法验证结果准确、可靠、重现性好，适用于伤科消痛酒的微生物限度检查。

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