山鸡新城疫和传染性支气管炎免疫抗体消长规律的研究

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(1.上海市奉贤区动物疫病预防控制中心，上海 奉贤201400；2.上海欣灏珍禽育种有限公司，上海 奉贤201400)

0 引言

鸡新城疫(ND)，又称亚洲鸡瘟，是由副粘病毒引起的一种禽类的急性、烈性、高度接触性传染病，其病毒按毒力强弱可分为低毒力、中毒力和强毒力3种类型。鸡科动物的各种禽类均对该病毒易感，且雏鸡比成年鸡易感性更高，临床常呈急性败血症症状。在非免疫或免疫力低下的鸡群中，一旦有强毒侵入，发病率和死亡率可达90%以上，对养鸡业危害巨大。

鸡传染性支气管炎(IB)是由冠状病毒属的传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种鸡的高度接触性传染病。其对各种日龄的鸡均易感，但5周龄以内的鸡症状明显，且各品种间无明显的差异，死亡率15%～19%；如果是肾病变型毒株感染，其发病率和死亡率可明显上升。成年鸡感染本病的死亡率较低，主要表现产蛋下降、蛋品质降低等症状，是危害养鸡业的重要疾病之一。

山鸡人工养殖是一项新兴的特养产业，其在国内的形成和发展仅有二十余年历史，但由于其特有的经济和观赏价值，近几年的市场需求快速增长，商品山鸡(活体)的市场售价已达48～50元/kg，国内人工养殖的规模和数量正逐年快速上升。野外生存时，山鸡具有较强的抗病能力；但快速发展的规模化人工养殖，在加速山鸡抗病能力退化的同时，也显著增加了各类疫病的发生概率，特别是在当前标准化水平较低的情况下，山鸡人工养殖缺乏科学的免疫程序和操作技术规范。山鸡种群的不规范免疫、免疫水平低下和免疫抗体的不平衡使免疫失败现象时有发生，造成山鸡养殖场中非典型鸡ND、IB等疫病时有发生，严重制约了山鸡养殖产业的发展。为此，笔者针对山鸡ND和IB的免疫问题，选择一家大型山鸡养殖公司，组织开展了一轮山鸡全周期(1个世代、56周)ND和IB免疫抗体的跟踪检测和消涨规律的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验山鸡

某大型山鸡养殖场1日龄祖代种山鸡雏苗1万羽，上海欣灏珍禽育种有限公司2016年7月2日出雏；孵化过程严格按照种蛋孵化流程操作。

该批试验山鸡的入孵种蛋为43周龄健康种山鸡所产。该批次亲本母山鸡在整个饲养期已分别于9日龄和12日龄采用新支H120弱毒疫苗喷雾或滴鼻免疫各一次并于35日龄、65日龄和195日龄分3次实施了新支流(或新支减)灭活疫苗的免疫；种山鸡开产后，每隔二个月采用新支H52弱毒疫苗饮水免疫一次。

1.1.2 免疫疫苗

1.1.2.1 新支H120二联弱毒疫苗

鸡新城疫、传染性支气管炎二联弱毒疫苗(L株+H120株)；生产商：哈药集团生物疫苗有限公司；批号：2015004；有效期：2016.11.23。

1.1.2.2 新支流三联灭活疫苗

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(L株+M41株+YBF003株)；生产商：青岛易邦生物工程有限公司；批号：150230905；有效期：2017.1.13。

1.1.2.3 新支H52二联弱毒疫苗

鸡新城疫、传染性支气管炎二联弱毒疫苗(L株+H52株)；生产商：青岛易邦生物工程有限公司；生产批号：160710502；有效期：2018.5.29。

1.1.2.4 新支减三联灭活疫苗

鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合症三联灭活疫苗(N79株+M41株+NE4株)；生产商：青岛易邦生物工程有限公司；批号：160960204；有效期：2016.8.31。

1.1.3 检测试剂

1.1.3.1 鸡新城疫检测试剂

抗原：哈尔滨维科生物技术开发公司生产；批号：20160504；效价为210。

标准阳性血清：哈尔滨维科生物技术开发公司生产；批号：20150721。

标准阴性血清：哈尔滨维科生物技术开发公司生产；批号：20150902。

1%鸡红细胞悬液：采集无新城疫抗体的健康公鸡血液10 mL，与等体积阿氏液混合后，用pH值为7.2,0.01moL/L的PBS液洗涤3次，每次均以2 500～3 000 rpm/min离心5 min；洗涤后用PBS液配成1%鸡红细胞悬液，2℃～8℃冰箱保存备用。

1.1.3.2 传染性支气管炎检测试剂

IDXXX传染性支气管炎病毒抗体检测试剂盒：北京爱得士元亨生物科技有限公司提供，批号：CN449；内含：IBV抗原包被板、阳性对照、阴性对照、空白对照、酶标抗体辣根过氧化物酶(HRPO)结合物、样品稀释液、TMB底物、终止液等。

结果判定：样品的S/P值<或=0.2判为阴性；样品的S/P值>0.2判为阳性，表明已接种过疫苗或感染过IBV。在免疫时效期监测和记录有代表性样品的抗体滴度是鸡群免疫状况的最好评价，得出的鸡群状况可对免疫全过程中抗体滴度的分布和变化进行分析。

1.2 方法

1.2.1 试验山鸡饲养

1.2.1.1 育雏期饲养

0～35日龄为育雏期；育雏舍采用智能内环境自动控制系统；雏山鸡采用四层叠层式立体育雏笼饲养。

1.2.1.2 保育期饲养

36～55日龄为保育期，采用内环境水供暖自动加热系统和双层阶梯式保育笼饲养。

1.2.1.3 育成期饲养

分育成前期和育成后期2个阶段，其中： 56～120日龄为育成前期，采用暗光照地面平养方式饲养；121日龄～开产(一般在190～195日龄)为育成后期，又称为产蛋准备期；采用3层叠层单鸡单笼式种山鸡笼饲养。

1.2.1.4 种用期

开产～淘汰(一般持续种用至56周龄全群淘汰)为种用期。采用三层叠层单鸡单笼式种山鸡笼饲养。

对试验山鸡全周期实施以下新城疫和传染性支气管炎免疫：详见表1。

1.2.3 采样与样品处理

1.2.3.1 亲本母山鸡采样

对试验山鸡的亲本母山鸡，在留取种蛋(43周龄)时随机采取20份血液样品。

1.2.3.2 育雏期采样

对刚出壳0日龄雏山鸡，随机抽取20羽采血；以后每隔10天随机抽取20羽雏山鸡采取血样，共采集0日龄、10日龄、20日龄、30日龄等四个批次、80份血样；由于雏山鸡体型偏小，此期采血可取心脏采血法或直接颈动脉放血采样。

表1 试验山鸡新城疫和传染性支气管炎免疫汇总表

1.2.3.3 育成期及后续样品采集

育成期60日龄时随机采取20份血样，以后每隔30 d在试验山鸡群中随机采取20份血样，共采集60日龄、90日龄、120日龄、150日龄、180日龄、210日龄、240日龄、270日龄、300日龄和330日龄等10个批次、200份血样。

1.2.3.4 样品处理与保存

我校已有“控制科学与工程”一级学科硕士点，也是广东省优势重点学科，“控制理论与控制工程”、“检测技术与自动化装置”两个专业是二级学科。依托学科建设，广东省教学质量与教学改革工程项目——电气工程综合训练中心，深入研究提升实验教学水平，形成技术积累，促进教学长足发展。专业教师除了完成自身教学任务，还应该根据学科发展方向和社会需要积极开展科研，将科研项目和成果作为实验教学内容更新、提高教学水平和实验技术方法提升的源泉。各级各类的研究成果转化为实验项目，为学生的课程设计、大型作业、毕业设计、科创竞赛选题提供依据，学生在进行这些实验项目时可以激发他们学习兴趣、锻炼他们的实验技术方法和创新能力[10]。

整个试验共采集试验山鸡14个批次、280份血液样品和43周龄亲本母山鸡1个批次、20份血液样品，总数为15个批次、300份血液样品；每个批次样品在采集后立即分离血清，标记后冷冻保存；至全部15个批次血样全部采集完成后集中监测。

1.2.4 样品检测

1.2.4.1 鸡ND抗体检测方法与判定标准

抗体检测方法：采用血凝抑制(HI)试验检测方法，试验山鸡全周期280份血样和亲本母山鸡20份血样同时进行鸡ND抗体检测

评定标准：HI滴度效价≧5log2判为抗体合格。

1.2.4.2 传染性支气管炎抗体检测方法与评定标准

抗体检测方法：采用ELISA试验方案对300份试验样品同时进行抗体检测。

评定标准：阴、阳对照成立确定试验有效，样品OD值>临界值判为阳性，否则判为阴性。

2 结果与分析

2.1 结果

2.1.1 亲本母山鸡1个批次样品ND免疫抗体监测结果

43周龄亲本母山鸡的20份血样，ND免疫抗体检测结果全部合格，且HI均值达8.6 log2，其中最高值为10 log2、最低值为7 log2；20份样品HI值分布情况见表2。

表2 20份亲本母山鸡血样ND免疫抗体HI值分布情况汇总表

2.1.2 亲本母山鸡1个批次样品IB免疫抗体检测结果

43周龄亲本母山鸡20份血样IB抗体检测结果全部合格，且OD均值达0.497，显著大于临界值0.0923；而在20份检测样品中，除1份样品的OD值接近临界值，其余19份样品的OD值均大于阳性对照血清的OD值。

2.1.3 试验山鸡14个批次样品ND抗体检测结果

14个批次、280份样品的ND抗体HI均值和阳性合格率汇总结果见表3和图1、图2。

表3 ND抗体HI均值和阳性合格率汇总表

图1 14个批次样品ND抗体HI均值折线图

图2 14个批次样品ND抗体阳性合格率折线图

2.1.4 14个批次样品IB抗体检测结果

14个批次样品IB抗体ELISA试验OD均值见表4。

14个批次样品IB抗体ELISA试验OD均值及合格率变动情况见图3和图4。

图3 各批次样品ELISA试验OD均值折线图

表4 各批次样品ELISA试验OD均值汇总表

2.2 分析

2.2.1 ND母源抗体分析

从表2、表3可以看到，亲本母山鸡在留取种蛋时的ND免疫抗体较好，20份样品全部合格，且HI均值达到8.6 log2的高水平；而该批种蛋孵化的雏山鸡也较好地继承了母源抗体，0日龄雏山鸡的HI均值达到了7.45 log2，且20份样品100%合格。

从表3中还可以发现，雏山鸡ND母源抗体的消退速度较快，至20日龄时的HI均值仅为4.2 log2，已低于了5 log2的合格标准，而且阳性合格率也降低至50%，低于70%的群体合格标准。从图一中可以更直观地看到母源抗体HI均值有一个平稳且较快速消退的阴性曲线；图二中的阳性合格率曲线也印证了这一现象；提示应在10日龄左右对雏山鸡进行一次ND有效免疫。

2.2.2 ND免疫抗体分析

结合试验山鸡免疫程序，分析表3可见，试验山鸡在9日龄和12日龄时采用喷雾和滴鼻的方式分别进行了新支H120二联弱毒疫苗的免疫后，该阶段的ND抗体HI均值仍呈现稳定下降现象，未见抗体反弹上升的趋势，说明这二次免疫未对试验山鸡产生免疫作用。

33日龄肌肉注射新支流三联灭活疫苗产生了较强的免疫反应，试验鸡群ND免疫抗体的HI均值快速上升至9.95 log2的高水平，且样品阳性合格率达到100%；69日龄采用新支流三联灭活疫苗加强免疫后，HI均值在8.35 log2以上的高位持续了4个多月的时间，且均衡稳定，样品阳性合格率也持续保持100%；194日龄加强免疫新支减三联灭活疫苗后，210日龄检测的免疫抗体HI均值在原高位又上升了2.5个滴度，达到了10.85 log2的高水平，并在240日龄时进一步提高至本次试验的最高峰11 log2，说明3次肌肉注射免疫均起到了较好的免疫作用。

图4 各批次样品ELISA试验阳性合格率分布折线图

后期在240日龄时对试验山鸡采用新支H52二联弱毒疫苗进行了一次饮水免疫，但表3的HI均值在此阶段呈现稳定下降趋势，说明这次饮水免疫未产生较强的免疫作用。但在330日龄试验山鸡即将淘汰时，在未采取任何免疫措施的情况下，免疫抗体HI均值有一个较强的反弹，图一的曲线可更直观地看到这一反弹现象；但记录显示此时鸡群未见异常，提示此期试验山鸡可能遭到了ND野毒侵袭，由于鸡群免疫抗体水平较高而使鸡群得到了有效保护。

2.2.3 IB母源抗体分析

分析试验结果可以看到，亲本母山鸡在留用种蛋时，其IB的免疫抗体达到了较高的水平，20份样品的OD均值达到了0.497，超过0.0923的临界值达0.4047。

但从表4可以看到，0日龄雏山鸡的母源抗体OD均值仅为0.098，且样品合格率仅为40%，提示雏山鸡未能较好地继承亲本母山鸡的母源抗体，而且母源抗体随着日龄增长而快速消退，至20日龄时，母源抗体已基本消失殆尽，说明试验山鸡在早期未能得到IB母源抗体的保护，应给予有效免疫。

2.2.4 IB免疫抗体分析

试验过程中，试验山鸡按原免疫程序于9日龄和12日龄时分别采用喷雾和滴鼻的方式进行了二次新支H120二联弱毒疫苗的免疫，但从表2和图3、图4可以看到，二次免疫后的OD均值均未见明显的提高，说明早期喷雾、滴鼻免疫作用较小、效果较差。

33日龄注射新支流三联灭活疫苗后，IB抗体开始回升，但速度较慢，60日龄时的群体合格率仅为25%；69日龄第二次注射新支流三联灭活疫苗后，抗体持续缓慢回升，90日龄和120日龄的OD均值分别为0.228和0.243，但在150日龄时的OD均值有一个突然快速上杨的过程，且1.035的OD均值成为了本次试验的最高值，比前次测定0.243的OD均值上涨了4倍多，而此阶段未进行过任何免疫，故疑似试验鸡群受到IB野毒侵袭，但记录显示鸡群无异常表现，说明鸡群的免疫抗体有效抵御了本次野毒的侵袭。以后几个批次样品的OD均值缓慢下降，但仍维持在0.335以上的较高水平，而同期样品的群体阳性合格率也持续维持在95%以上较高水平，说明IB灭活疫苗的注射可起到较好的免疫作用。

240日龄采用新支H52二联弱毒疫苗饮水免疫后，270日龄的OD均值上升了0.156，达到了0.491的高值，这一结果与亲本母山鸡的抗体水平基本相符，说明后期采用中等毒力疫苗饮水免疫可有效提升群体免疫抗体水平。

3 讨论

(1)试验结果证明：在亲本母山鸡获得较好免疫的基础上，ND母源抗体可较好地遗传给子代，且维持时间较长；而IB母源抗体的遗传性较差，且母源抗体的消退速度也较快。

(2)注射免疫新支流(或新支减)三联疫苗的免疫作用较明显，特别是ND抗体，可快速将HI均值提高至最高峰，而IB抗体虽然上升较慢，但二次免疫后即可达到较高水平，而且抗体消退也较慢。

(3)育雏期采用喷雾、滴鼻等方式免疫新支H120二联疫苗的效果较差，未能起到应有的免疫作用。后期采用新支H52二联弱毒疫苗饮水免疫，对提高IB的抗体有较好的推动作用。

(4)由于存在着IBV在鸡体内对NDV有干扰的问题，所以在理论上和实践中，对ND和IB联苗的使用价值一直存有争议；但由于这一联苗具有使用方便和节省资金等优点，故应用者较多。本次试验的相关结果也是对这一争议的佐证和应用方法的完善。

(5)建议免疫程序：见表5。

表5 ND、IB建议免疫程序