分枝杆菌实验室诊断方法比较

刘 畅，徐英春，宋红梅，杨文航，杨启文，刘亚丽，郭莉娜，刘文静， 赵 颖，窦红涛，王 瑶，王 贺，赵玉沛，孙宏莉

1中国医学科学院 北京协和医学院研究生院，北京 100005 中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 2检验科 3基本外科，北京 100730

传统分枝杆菌实验室诊断方法主要为分枝杆菌培养和涂片抗酸染色，近年来随着分子生物学技术的发展，荧光PCR技术已广泛应用于分枝杆菌的检测。如何快速合理地检测分枝杆菌成为实验室检测的主要问题。本研究对北京协和医院连续3年分枝杆菌实验室检测情况进行回顾性分析，探讨比较3种方法在医院中的应用价值，为临床医生快速送检提供参考。

1 材料和方法

1.1 标本来源

回顾性分析2013年1月至2015年12月北京协和医院实验室分枝杆菌检测数据，剔除同种标本类型的重复送检标本，多次送检结果一次阳性即视为阳性。共10 326份培养、25 269份涂片抗酸染色、5949份PCR-荧光探针法检测标本纳入本研究，主要包括外周血、呼吸道标本、无菌体液、组织标本等类型。

1.2 实验室检测方法

1.2.1 分枝杆菌培养

分枝杆菌罗氏培养：液化标本加无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)至约45 ml，离心15 min，倒掉上清液，添加1～3 ml PBS以中和PH至6.8，取0.5 ml接种至罗氏培养管，35 ℃孵育，前2周每周观察2次，以后每周观察1次。

全自动分枝杆菌培养：按照MGIT 960全自动分枝杆菌液基培养检测系统(BD,美国)规定进行[1]。

1.2.2 涂片抗酸染色

涂片抗酸染色采用金胺(O)染色初筛，对可疑阳性标本进行萋尼染色[2种染液均购自珠海贝索(BASO)生物技术有限公司]，染色后镜检确认。

1.2.3 PCR-荧光探针法

试剂盒购自博奥生物有限公司。标本液化处理后使用核酸提取仪(Extractor 36)进行DNA提取，PCR扩增仪(RT-cyclerTM236基因扩增仪)扩增，条件设置：37 ℃ 300 s，94 ℃ 180 s，94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环，50 ℃ 10 s。Ct值<40为阳性[2]。

1.3 观察指标

分析3年间培养、涂片抗酸染色和PCR-荧光探针法的呼吸道、无菌体液、组织等标本的送检量和阳性标本检出率；以分枝杆菌培养结果为金标准，计算涂片抗酸染色法和PCR-荧光探针法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及准确性。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，3年间阳性标本检出率比较采用卡方检验。涂片抗酸染色法和PCR-荧光探针法的诊断价值比较采用配对McNemar卡方检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 分枝杆菌培养送检标本种类、数量及检出率

2013至2015年全院分枝杆菌培养送检标本数量呈逐年上升趋势。其中MGIT 960全自动分枝杆菌液基培养检测标本8863份，罗氏培养标本1463份。标本种类以血液标本和呼吸道标本中的痰标本较多，分别占总标本量的31.4%(3244/10 326)和24.1%(2491/10 326)，其次为无菌体液(胸水、尿液、脑脊液和腹水)和组织标本(淋巴结活检和肺组织)。不同标本类型分枝杆菌检出率有所不同，其中呼吸道标本中的气管支气管吸取物(10.1%)和痰(9.8%)检出率较高，其次为胸水(6.6%)和腹水(6.8%)。各年度送检标本总体分枝杆菌检出率相近(5.5%～5.7%)，其中淋巴结活检和肺活检标本检出率有所升高，其他标本的检出率无明显变化。3年间总标本检出率差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

2.2 涂片抗酸染色送检标本种类、数量及检出率

分枝杆菌涂片抗酸染色送检标本数亦呈逐年上升趋势，标本数量为培养的2.4倍。以痰标本最多，占总标本量的40.3%(10 196/25 269)，其次为毛刷，占14.9%(3754/25 269)。阳性标本以呼吸道标本(痰、毛刷、气管支气管吸取物和支气管肺泡灌洗液)为主，其中气管支气管吸取物检出率较高，为3.8%。无菌体液中菌量相对较少，造成检出困难，检出率低，胸水和腹水3年检出率均为0。分泌物(16.9%)和脓液(11.2%)的检出率最高。3年间总标本检出率差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

2.3 PCR-荧光探针法送检标本种类、数量及检出率

PCR-荧光探针法检测结核/非结核分枝杆菌核酸是2013年本院检验科新开展的项目，3年间送检结核/非结核分枝杆菌核酸标本数为5949份，其中405份标本分离出结核分枝杆菌，124份标本分离出非结核分枝杆菌。标本数量以痰和气管支气管吸取物最多，分别占总标本数量的40.4%(2403/5949)和22.8%(1359/5949)。标本种类以呼吸道标本(痰、气管支气管吸取物和支气管肺泡灌洗液)为主，其次为无菌体液(胸水、尿液、脑脊液和腹水)。阳性标本检出率以脓液最高(20.6%)，其次为呼吸道标本中的气管支气管吸取物(12.3%)和淋巴结活检(11.2%)。3年间总标本检出率差异具有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表 1 2013-2015年分枝杆菌培养送检标本种类、 数量及检出率

2013至2015年，PCR-荧光探针法阳性标本总检出率(8.9%)明显高于培养(5.6%)和涂片抗酸染色(1.9%)(P<0.05)。

2.4 实验室分枝杆菌检测方法诊断价值比较

以培养结果为金标准，对所有同时采用培养、涂片抗酸染色和PCR-荧光探针法检测的3349份标本的检测结果进行分析。涂片抗酸染色的敏感度较低，在26.6%～40.3%之间波动，特异度、阴性预测值和阳性预测值无明显变化。3年内250份涂片抗酸染色阴性标本培养出了分枝杆菌，随着标本量的上升，涂片抗酸染色阴性但培养阳性的标本量也逐年上升(表4)。

2013至2015年3年总体数据显示，PCR-荧光探针法的敏感度为40.3%～44.4%，特异度为92.8%～96.6%(表5)。

表 2 2013-2015年分枝杆菌抗酸染色送检标本种类、 数量及检出率

表 3 2013-2015年分枝杆菌PCR-荧光探针法送检 标本种类、数量及检出率

表 4 2013-2015年涂片抗酸染色法检测分枝杆菌的 评价指标比较

比较涂片抗酸染色及PCR-荧光探针法检测的实验室诊断价值， PCR-荧光探针法的敏感度高于涂片抗酸染色(42.9%比31.3%，P<0.05)，特异度低于涂片抗酸染色(95.2%比97.4%，P<0.05)，阳性预测值、阴性预测值和准确性差异均无统计学意义。

表 5 2013-2015年PCR-荧光探针法检测分枝 杆菌评价指标比较

3 讨论

目前，分枝杆菌检测实验室方法包括分枝杆菌培养、涂片抗酸染色和PCR-荧光探针法。涂片抗酸染色用金胺(O)染色初筛，对可疑阳性标本进行萋尼染色确诊。涂片抗酸染色操作简便快速，成本低，但敏感度低，含菌量达104才能检出。显微镜观察要求检验人员具备一定的经验，且由于人工操作及取样的不确定性，存在一定漏诊率。一般临床要求痰标本连续送检3次以提高涂片检出率[3]。分枝杆菌培养包括改良罗氏培养和液体培养(如BD MGIT 960液基培养)。改良罗氏培养需要4～6周，时间较长且需定期观察，不利于患者的管理和治疗[4]。目前，BD MGIT 960液基培养是国内外公认的新的分枝杆菌实验室诊断“金标准”，8～14 d 可获知结果，是一种更加标准化的技术[5- 7]。PCR-荧光探针技术因其简单快速、全封闭扩增、重复性好等优点并通过特异度引物和探针技术保障了实验的准确性，2.5 h即可完成一个反应，对于阳性结果可区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，补充了细菌学检测的不足，其缺点是结果易受环境污染而呈假阳性，且不能判断标本中是否为活菌[2]。

本研究分析比较了北京协和医院2013至2015年间3种分枝杆菌检测方法，临床分枝杆菌实验室检测的标本送检量逐年上升。涂片抗酸染色送检标本数量最多，为培养的2.4倍，但其阳性标本检出率较低，仅为1.9%，且3年间检出率无明显变化。以培养为金标准，涂片抗酸染色敏感度较低(31.3%)，即漏检标本较多；特异度较高为97.4%，高于PCR-荧光探针法的95.2%(P<0.05)。PCR-荧光探针法分枝杆菌总检出率(8.9%)高于涂片抗酸染色(1.9%)和培养(5.6%)，差异具有统计学意义(P均<0.05)。2015年PCR-荧光探针法阳性标本检出率略有下降，可能原因为送检PCR-荧光探针法的标本总量增多，而阳性标本数并未增加，其敏感度为42.9%，高于涂片法31.3%(P<0.05)。

涂片抗酸染色和PCR-荧光探针法检测的阳性预测值均较低，分别为59.7%和52.2%，推测阳性预测值低可能原因有标本污染或标本中细菌繁殖导致假阳性或作为“金标准”的培养法敏感度较低[8]，此时应结合临床症状进行判断。

分枝杆菌培养为实验室诊断的“金标准”，但检测周期长。涂片抗酸染色简便快捷，但阳性样本检出率和敏感度低。PCR-荧光探针检测作为新型的分子检测技术，与培养相比检测周期明显缩短，与涂片抗酸染色相比，具有较高的检测敏感度，对于阳性结果可区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，直接诊断结核病，在实验室分枝杆菌属的检测中具有重要价值[9- 10]。

本研究的局限性：(1)本文为回顾性研究，可能存在一定的信息偏倚。(2)在培养数据分析时，本文将罗氏培养与MGIT 960全自动分枝杆菌液基培养数合在一起进行分析，且MGIT 960全自动分枝杆菌液基培养所占比例逐年上升，可能会存在混杂偏倚，对结果的判断产生影响。(3)本研究仅对实验室检测方法进行了对比分析，未结合临床诊断信息，未能对比实验室和临床诊断的差异性。

参 考 文 献

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