上海市2011—2017年风疹病毒基因特征分析

杨玉颖 王静 唐伟 朱贞 李云逸 王嘉瑜 李崇山 刘畅

200025上海交通大学医学院免疫学与微生物学系(杨玉颖、刘畅)；200336上海市疾病预防控制中心病原生物检定所(杨玉颖、王静、唐伟、李云逸、王嘉瑜、李崇山)；102206北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(朱贞)

风疹(rubella)是一种常见的发热出疹性疾病,其病因为风疹病毒(rubella virus,RV)感染。RV是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员,虽然RV只有一个血清型,却有多个基因型。世界卫生组织(world health organization,WHO)推荐使用E1蛋白编码区739个核苷酸(nucleotide,nt)(nt8731～9469),作为进行RV分子流行病学研究的区域[1]。根据该739nt片段核苷酸最小差异为8% ～10%的原则,RV在遗传进化树上分为2个分支(Clade 1和Clade 2)。目前在2个分支内共划分为13个基因型,其中 12 个为正式基因型(1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、2A、2B、2C),另外一个为临时基因型(1a)[2]。

此前有报道2B基因型RV于2011年在上海流行[3]。为研究2B基因型RV是否依然在本市存在流行及其基因特征,完善上海市风疹分子流行病学监测基线数据,选择2011—2017年上海市报告疑似麻疹/风疹病例中经实验室诊断排除麻疹,确定为风疹病例所对应咽拭子标本进行RV分离和鉴定,并对病毒E1基因扩增测序进行基因特征分析。

1 材料与方法

1.1 标本采集与运送所有病例信息均来自中国疾病预防控制信息系统(China Information System for Disease Control and Prevention,CISDCP)和麻疹监测信息报告管理系统(Measles Surveillance System,MSS)。本研究中所用的所有病例标本均采集自符合《上海市麻疹风疹监测方案》中所规定病例定义的疑似麻疹或风疹病例,由上海市辖区范围内各医院或各区疾病控制中心采集、运送。2014年起由各麻疹风疹网络实验室进行核酸检测,检测结果阳性者再送上海市疾病预防控制中心进行麻疹病毒分离。同时采集血清标本由各麻疹风疹网络实验室进行IgM抗体检测。上海市疾病预防控制中心定期对结果进行复核。

1.2 病毒分离、核酸提取及RV鉴定按照《中国麻疹/风疹网络实验室标准操作规程(2015版)》操作,实验所用Vero/SLAM细胞由中国疾病控制中心国家麻疹/风疹实验室提供。使用 QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen,德国)从第3代病毒培养物中提取病毒RNA,具体操作参照试剂盒说明书。选择引物RV11-RV12鉴定RV[4-5],使用PrimeScript One Step RT-PCR kit(Takara,中国)扩增片段185 bp。扩增产物进行毛细管电泳,阳性标本进行后续实验。

1.3 E1基因的扩增与测定从GenBank中下载RV基因组全序列,并据此设计E1基因引物：正义链为 F1：5′-TCGTCCTGCTGGTCCCGTGG-3′,F2：5′-CCCCACCGACACCGTGATGA-3′,F3： 5′-GTGGGTC ACGCCTGTCATAG-3′；反义链为 R1：5′-GTTGTCCGT GCGGCGTGTTG-3′,R2：5′-GCGGTGACGAACTTCC CAGG-3′,以及文献引物 RUB3：5′-TTTT TTTTTTT TTTTTTTCTATACAGCAACAGGTGC-3′[6]。 使用 Sup erscriptⅢ Platinum Taq High Fidelity kit(Invitrogen,美国)扩增病毒E1基因的全序列(nt8136～9780)：55℃逆转录30 min,94℃变性2 min,94℃ 10 s、55℃15 s、68℃ 1min,40个循环后,68℃延伸5 min。扩增产物经毛细管电泳鉴定,阳性产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.4 生物信息学分析使用Sequencher 5.4.6软件(GeneCode,美国)拼接序列,使用Mega 6.0软件[7]进行序列比对,采用邻接法(neighbor-joining method,NJ)构建基因亲缘性关系树,进化树进行了1 000次重复构建；使用BioEdit Sequence Alignment Editor 7.0.9.0软件[8]分析核苷酸和氨基酸(amino acid,aa)序列同源性及变异情况。

2 结果

2.1 2011—2017年上海市风疹监测流行病学信息2011—2017年上海市风疹报告发病率为0.01～3.57/10万,2012年发病率最高,2016—2017年发病率持续下降。全市各区均有病例报告,报告病例数以浦东新区、嘉定区、松江区和闵行区最多。年龄分布以15～39岁青少年和成年人最多。全年均有病例发生,4～6月份发病数最多,其中2015年以1～5月份病例数最多。

2.2 RV的分离鉴定与基因型的确定2011—2017年符合条件咽拭子标本共计684份,病毒分离物经RV11-RV12引物对扩增鉴定,共分离到395株RV,全部为散发病例,且标本均采集自出疹前后5 d内。395株RV分离株均为14岁以上青少年或成年人,无儿童病例,具体信息见表1。经上述3对引物扩增后,共获得377株RV分离株739nt片段核苷酸序列,基于该片段与WHO各基因型参考株序列构建系统进化树(图1)[3]。结果发现,377株RV分离株中109株为1E基因型,且这些分离株与来自中国的参考株(RVi/Shandong.CHN/0.02/)亲缘性关系更近(bootstrap值为98)；268株为2B基因 型,其中 RVi/Shanghai.CHN/16.14/6、RVi/Shanghai.CHN/15.16/4、RVi/Shanghai.CHN/19.16/2、RVi/Shanghai.CHN/20.16/和 RVi/Shanghai.CHN/21.16/等5株分离株在2B基因型中成一个独立小分支。具体基因型鉴定情况见表2。

表1 上海市2011—2017年RV分离株信息汇总Tab.1 Information about RV isolates during 2011-2017 in Shanghai

2.3 核苷酸序列差异及变异位点分析所有1E基因型分离株之间核苷酸序列相差0～22个核苷酸(0% ～3.0%)；与该基因型2株WHO参考株(RVi/Shandong.CHN/0.02/和RVi/Kuala Lumpur.MYS/0.01/)之间的核苷酸序列相差8～29个核苷酸(1.1%～4.0%)。与该基因型中国参考株(RVi/Shandong.CHN/0.02/)相比,所有1E基因型分离株E1基因 739nt片段中共有 4个位点(nt8737、nt8836、nt9160和nt9316)存在完全一致的突变,以上位点突变后的碱基与马来西亚参考株(RVi/Kuala Lumpur.MYS/0.01/)一致。除RVi/Shanghai.CHN/30.12/2外,其他108株1E基因型分离株在nt9244位点发生T→C的无义突变(图2)。所有2B基因型RV分离株之间核苷酸序列相差0～48个核苷酸(0% ～6.5%)；与该基因型3株WHO参考株(RVi/Anhui.CHN/0.00/2、RVi/Washington. USA/16.00/和 RVi/TelAviv. ISR/0.68/)之间相差12～48个核苷酸(1.7% ～6.5%),且与美国华盛顿州的WHO参考株(RVi/Washington.USA/16.00/)差异最小。与上述WHO参考株(RVi/Anhui.CHN/0.00/2)相比,所有2B基因型分离株E1基因739nt片段中在 nt9092(Adenine→Guanine,A→G),以及5株成独立小分支的2B基因型分离株在nt9371(G→A)和nt9387(Thymine→Cytosine,T→C)位点均发生突变,导致所编码氨基酸的变化(图2)；此外,与3株WHO参考株相比,所有2B基因型分离株在nt8737位点,以及除5株成独立小分支外的其他2B基因型分离株在 nt8740、nt8749、nt8770、nt8 977 和 nt9 112 等位点均发生无义突变。

表2 上海市2011—2017年RV分离株基因型鉴定Tab.3 Genotype identification of RV isolates during 2011-2017 in Shanghai

图1 2011—2017年上海市部分RV分离株与WHO各基因型参考株基于E1基因739nt(nt8731～nt9469)构建的系统进化树Fig.1 The phylogenetic tree of part of rubella strains isolated during 2011-2017 in Shanghai compared to the WHO reference strains for each genotype based on the 739 nucleotides(nt8731～nt9469)of E1 gene

2.4 氨基酸序列差异及变异位点分析所有1E基因型分离株之间相差0～4个氨基酸残基(0% ～1.7%),与该基因型2株 WHO参考株(RVi/Shandong.CHN/0.02/和RVi/Kuala Lumpur.MYS/0.01/)之间的氨基酸序列相差0～4个氨基酸残基(0% ～1.7%)；所有2B基因型RV分离株之间氨基酸序列相差0～5个氨基酸残基(0% ～2.1%),与该基因型3株WHO参考株(RVi/Anhui.CHN/0.00/2、 RVi/Washington. USA/16.00/和 RVi/TelAviv.ISR/0.68/)之间的氨基酸序列相差0～4个氨基酸残基(0% ～1.7%),且与美国华盛顿州的WHO参考株(RVi/Washington.USA/16.00/)差异最小。

图2 2011——2017年上海市部分RV分离株与WHO参考株基于E1基因739nt(nt8731～9469)变异位点分析Fig.2 The nucleotide mutation analysis of part of rubella strains isolated during 2011-2017 in Shanghai compared to the WHO reference strains based on the 739 nucleotides(nt8731～9469)of E1 gene

本研究所有377株RV分离株中发现的核苷酸突变大多为无义突变,并不引起所编码氨基酸的变化,只有少数几个位点存在氨基酸突变(图3)。所有RV分离株在E1蛋白aa279位点均为缬氨酸(Valine,Val279),与1E和2B基因型WHO参考株相比,仅和2B基因型WHO参考株(RVi/Anhui.CHN/0.00/2)不同,该参考株此位点为异亮氨酸(Isoleucine,Ile279),此位点为E1蛋白的抗原表位。除了RVi/Shanghai.CHN/26.11/2之外的所有中国1E基因型RV在aa338位点发生相同突变,由亮氨酸(Leucine,Leu338)突变为苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe338),而2B基因型分离株以及其他基因型WHO参考株均未发生改变。同时发现5株成独立分支的2B基因型分离株在aa372位点发生Val372→Ile372突变,在aa377位点发生 Val377→丙氨酸(Alanine,Ala377)的突变。

图3 2011—2017年上海市部分RV分离株与WHO参考株基于E1蛋白(aa159～404)氨基酸变异位点分析Fig.3 The amino acid mutation analysis of part of rubella strains isolated during 2011-2017 in Shanghai compared to the WHO reference strains based on the E1 protein(aa159～404)

3 讨论

根据WHO所推荐的RV基因分型标准,确定以El蛋白编码区的739个核苷酸(nt8731～9469,aal59～404)作为靶序列进行基因型划分和分子流行病学研究[1]。

本研究对上海市2011—2017年报告疑似麻疹风疹病例中分离到的RV进行分子流行病学分析。除2017年外,其余年份均分离到RV。377株RV分离株全部属于1E基因型或2B基因型,所有1E基因型分离株与来自中国的WHO参考株(RVi/Shandong.CHN/0.02/)亲缘性关系更近。李崇山等[3]报道1E基因型是2001—2011年本市RV优势流行基因型,本研究中1E基因型仍是2011—2013年上海市RV优势流行基因型,但在2014年则被2B基因型取代,自2015年起未再监测到1E基因型。上述研究发现上海市1E基因型分离株分为两个进化分支(Cluster A和Cluster B)[3],其中Cluster A中分离株数量较多,且包括2001—2011年多个年份的分离株,但在本次研究中所有1E基因型分离株均属于Cluster A。朱贞等[10]对2001—2015年中国大陆流行的1E基因型RV分子流行病学研究发现类似的进化结果。上海地区2B基因型RV在2011年首次被发现[3],本次研究再次监测到2B基因型RV在上海的流行,且2012—2016年期间持续存在,并替代1E基因型成为2014—2016年上海市RV优势流行基因型。

从系统发生树上发现,5株分离株(RVi/Shanghai.CHN/16.14/6、 RVi/Shanghai.CHN/15.16/4、 RVi/Shanghai.CHN/19.16/2、RVi/Shanghai.CHN/20.16/和RVi/Shanghai.CHN/21.16/)在2B基因型中成一个独立小分支,并且在aa372和aa377位点发生突变,这两个位点的突变为这5株分离株独有,其他分离株和WHO参考株中未发现该突变。研究发现在2015年贵州省的一起风疹暴发中有2株2B基因型RV在aa377位点发生相同突变[9]。经核苷酸序列同源性分析发现,所有268株2B基因型分离株与从美国华盛顿州2000年分离到的WHO参考株(RVi/Washington.USA/16.00)最为接近。除上述5株分离株外的263株2B基因型分离株与上海市之前分离自2011年的3株2B基因型(SH11009、SH11052和SH11106)之间的核苷酸序列同源性达98%以上。经与其他国家或地区的RV比对发现,分离自2011年的4株及2013年的1株RV与中国香港的1株RV(GenBank No.：FJ656218)核苷酸同源性为100%,提示存在跨区域传播的可能。

本次研究同时发现除1株(RVi/Shanghai.CHN/26.11/2)外的所有中国1E基因型RV E1蛋白aa338位点发生相同突变(Leu338→Phe338),朱贞等人[10]在对我国2003—2007年RV基因特征分析中首次发现中国1E基因型RV在这一位点的独有突变,之后在浙江省[11]、吉林省[12]等地RV分离株基因特征分析中都相继发现了相同的突变。但李崇山等人[4]的研究中,上海地区2001年分离到的7株1E基因型RV中有5株未发生这一突变,aa338位点仍为 Leu338,与 WHO 1E基因型(RVi/Kuala Lumpur.MYS/0.01/)及2B基因型参考株相同,说明这一突变可能于2001年前后还未在所有1E基因型RV中发生。由于我市2010年之前的RV样品量少,故未能扩大检测范围确定这一突变的具体时间。通过1E基因型RV比对发现,俄罗斯(2006年)、中国(2007年台湾,2012年香港)、美国(2008年)以及日本(2010—2011年)的RV分离株中都存在这一位点的突变,其中部分毒株已被证实由中国大陆输入[13-14]。

截止2015年,除WHO非洲区和东地中海区之外的其他4个区域都确立了消除或控制风疹和CRS的目标,WHO美洲区在2015年宣布阻断本土RV的传播,率先实现了消除风疹和CRS的目标。目前,上海市风疹病毒学监测还不够全面,有待进一步加强监测的力度,为追溯RV的传染源和传播链以及制定切实有效的风疹疫苗免疫策略提供科学依据。

利益冲突无