丙型肝炎病毒和丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型的关系研究

周静娣 高国生 刘兴晖 胡耀仁

315010宁波市第二医院(周静娣、高国生、胡耀仁)；200135上海市浦东新区公利医院(刘兴晖)

全世界有超过1.7亿人感染丙型肝炎病毒(hepatctis C virus,HCV),严重危害人类健康[1]。丝氨酸肽酶抑制剂Kazal 1型(SPINK1)是一种炎性蛋白,以较高的浓度存在于胰腺和胰液中,在健康人群中,肝脏是SPINK1的主要来源。研究表明,SPINK1在肝癌患者表达水平升高[2],HCV是导致原发性肝癌的主要诱因之一,但目前为止,HCV对SPINK1的调节作用还不是很清楚。本研究旨在探讨HCV对SPINK1的调节作用及其临床意义,为HCV相关疾病的诊治提供一定的理论基础。

1 对象与方法

1.1 一般资料收集HCV感染的患者92例,包括男性53例,女性39例,平均年龄51.8±20.3岁。选取86例健康体检者作为对照组,其中男性49例,女性37例,平均年龄42.2±15.7岁,所有患者均排除其他嗜肝病毒感染,且均未接受干扰素(IFN)和直接抗病毒(DAA)药物抗病毒治疗。

1.2 试剂含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1细胞由本室保存[3]；M-MLV逆转录酶购自美国Promega公司；SPINK1单克隆抗体购自购自美国美国Sigma公司；SPINK1 ELISA检测试剂盒购自厦门慧嘉生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养：Huh7.5.1细胞培养在含10%的胎牛血清(含100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素)DMEM培养基中,在37℃,5%的CO2细胞培养箱中进行培养,每个实验组做3个复孔。

1.3.2 RT-PCR检测：提取含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1细胞及其对照细胞的总RNA,MMLV逆转录酶反转录成cDNA,SPINK1基因的检测引物：上游引物：5’-TAACAGGCATCTTTCTTCT-3’；下游引物：5’-AGTATTTCCATCAGTCCC-3’,进行PCR扩增,同时设立β-actin作为对照[2],产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3 Western blot(WB)：细胞裂解液裂解Huh7.5.1细胞,加入上样缓冲液后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,将蛋白转至NC膜上,分别加入SPINK1单克隆抗体(1∶2 000)和羊抗兔多克隆抗体(1∶5 000),设立β-actin作为对照,采用底物化学发光(ECL)进行显色。

1.3.4 ELISA检测：细胞上清及血清SPINK1的含量采用ELISA进行检测,操作按照说明书进行,实验重复3次。

1.4 统计学方法数据分析采用SPSS16.0软件,SPINK1含量以均数±标准差(±s)表示,各组间均数的比较采用t检验,P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

图1 RT-PCR检测SPINK1 mRNA的表达Fig.1 Expression of SPINK1 mRNA determined by RT-PCR

图2 Western blot检测SPINK1蛋白的表达Fig.2 Expresssion of SPINK1 protein detected by Western blot

图3 感染HCV的Huh7.5.1细胞与对照细胞上清中SPINK1的含量比较(∗P＜0.05)Fig.3 Comparison of SPINK1 content of Huh7.5.1 cells infected with HCV and control cell supernatant(∗P＜0.05)

2.1 HCV上调SPINK1 mRNA和蛋白的表达我们采用RT-PCR和WB检测了JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1及其对照细胞SPINK1 mRNA和蛋白的表达,结果表明,感染了HCV的Huh7.5.1细胞SPINK1 mRNA和蛋白的表达水平升高。见图1和图2。细胞上清中SPINK1检测结果显示,感染了HCV的Huh7.5.1细胞SPINK1含量(58.7±16.2μg/L)明显高于对照细胞(41.2 ±10.5μg/L),统计学分析有显著性差异(P=0.016)。见图3。

2.2 HCV感染患者SPINK1血清水平升高为证实HCV对SPINK1的调节作用,我们采用ELISA检测了HCV患者和正常对照组SPINK1的血清含量。结果表明,与对照组相比(17.9±4.5μg/L),SPINK1含量在丙肝患者组明显升高(67.5±19.8 μg/L),(P=0.016)。见图4。同时,Spearman相关分析显示年龄与SPINK1血清学水平之间无相关性(r=0.116,P＞0.05)。

3 讨论

图4 正常对照组和HCV患者组SPINK1的血清水平比较(∗P＜0.05)Fig.4 Comparison of serum levels of SPINK1 of the normal control group and HCV patients group

SPINK1又被称为肿瘤相关胰蛋白酶抑制剂(TATI)和胰腺分泌胰蛋白酶抑制剂(PSTI),是一种分泌性多肽,位于5号染体(5q32),基因组约为7.5 kb,基因产物由79个氨基酸组成,其主要生理功能是抑制胰蛋白酶原等多种丝氨酸蛋白酶原活性,拮抗胰腺等组织的“自身消化”[4-5]。研究表明,SPINK1在乙肝病毒(HBV)和HCV患者肝组织表达升高[6],但HCV能否在细胞水平调节SPINK1的表达还不清楚。

本研究检测了含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1细胞株及其对照细胞mRNA和蛋白表达水平,结果显示,HCV能够在转录和翻译水平上调SPINK1的表达。SPINK1是分泌性蛋白,细胞上清检测结果也显示含JFH-1株 HCV病毒感染的Huh7.5.1细胞株高于对照细胞,表明HCV能够在细胞水平促进SPINK1的合成和分泌,进一步的血清检测结果发现,HCV患者SPINK1的血清含量明显高于正常对照组(因正常对照组和患者之间的年龄存在差异,为避免表达水平的差异是由于年龄原因导致的,故进一步对年龄与SPINK1血清水平之间的相关性作了分析,结果证明两者之间无相关性),证实了HCV能够在体内外上调SPINK1的表达。

需要指出的是,IFN和直接抗病毒(DAA)药物是临床治疗HCV的常用药物,但目前未见抗病毒药物对SPINK1表达影响的相关报道,因此,本研究我们选取了未接受干扰素(IFN)和直接抗病毒(DAA)药物抗病毒治疗HCV患者。

HCV感染是肝癌的主要诱因之一,病毒与宿主的相互作用在肝癌的发生机制中起重要作用[7],病毒感染机体后诱发机体诱发宿主免疫反应、炎症反应,最终导致肝细胞大量重生而诱发致癌效应[8]。Lu X等证实SPINK1能够抑制细胞的凋亡[9],同时,HCV的复制能够促进SPINK1的表达[6],本研究也证实了HCV在体内外上调SPINK1的表达,因此,HCV感染宿主肝细胞后,通过促进SPINK1的表达来抑制肝细胞凋亡,以利于HCV在肝细胞内不断的复制和机体持续的炎症反应,从而促进肝癌的发生[5]。

研究证实,SPINK1的表达水平与肝癌进程相关,高水平SPINK1对于肝癌的早期诊断及术后复发有一定的预测作用[2],因此,血清中SPINK1的检测将为HCV相关疾病的诊治提供线索。

总之,本研究探讨了HCV对SPINK1的调节作用,为揭示HCV的致癌机理奠定了一定基础,但HCV调节SPINK1表达的具体分子机制及IFN对SPINK1表达的影响有待进一步研究。

利益冲突无