VgDGAT1A转基因大豆高代材料的表型分析

张飞，高秀清，刘宝玲，张靖洁，薛金爱，张红梅*，李润植*

(1.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 分子农业与生物能源研究所，山西 太谷 030801)

大豆(Glycinemax)是我国和世界主要粮油作物之一，其蛋白质含量高，氨基酸种类多，钙磷铁含量丰富，脂肪含量高。大豆油除了作为人类食用油的主要来源之外，还用于生物柴油生产、食品和油脂化工业等[1]。大豆油的市场消费量逐年增长[2]，培育高油大豆品种尤为重要。因大豆种子油含量与蛋白含量呈负相关,常规育种手段难以克服，不易培育获得蛋白质和油脂含量双高的新品种。

二酰基甘油酰基转移酶(Diacylgycerol acyltransferase，DGAT)是一种内质网细胞微粒体酶，它能够催化二酰甘油加上脂肪酸酰基生成三酰甘油，是三酰甘油合成的限速酶。根据DGAT的结构、亚细胞定位等的差异将其分为4种类型: DGAT1、DGAT2、WS /DGAT和胞质内DGAT (Cyto DGAT)。DGAT1属于酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶家族(acyl CoA: cholesterol acyltransferase，ACAT)，而DGAT2则属于DGAT2超家族[3,4]，DGAT1和DGAT2蛋白主要结合在内质网膜上，属微粒体酶。WS /DGAT和Cyto DGAT是近年发现的新类型，目前研究较少。研究表明，DGAT1在高等植物种子TAG形成中发挥重要作用。DGAT1在大豆的幼根、茎、叶子、花和幼嫩种子等器官中均有表达，并且具有时空性，超表达二酰甘油酰基转移酶DGAT1，能增加三酰甘油的含量，进而增加大豆种子的出油率。

Jako等研究发现，拟南芥DGAT1突变体AS11中种子含油量下降20%～40%，而过量表达拟南芥AtDGAT1，转基因拟南芥种子的DGAT活性比野生型提高10%～70%，并且提高了种子含油量和种子的千粒重[5]。Zheng等发现表达普通玉米DGAT1基因的玉米种子含油量、胚含油量和油酸含量分别提高了9.3%、12.4%和40.5%； 而表达高油玉米DGAT1基因的玉米种子含油量、胚含油量和油酸含量分别提高27.9%、26.1%和84.5%[6]。Zhang等使烟草DGAT1基因沉默后，引起烟草种子油含量减少9%～49%[7]。刘正杰等发现陆地棉内源基因GhDGAT1沉默后转基因种子中GhDGAT1基因表达量显著降低,种仁含油量下降,下降幅度达3.13%[8]。Lardizabal等在大豆种子中过表达真菌DGAT2基因，使大豆种子的总含油量提高了1.5%[9]。这说明DGAT1确实在油脂合成累积过程中起关键作用。研究表明，斑鸠菊二酰甘油酰基转移酶VgDGAT1A在发育种子中高量表达[10]。异源超表达VgDGAT1使亚麻荠种子含油量从野生型的37%提高到46%～51%[11]。VgDGAT1可以显著的提高棉花种子的含油量18%～40%[12]。由此可知，VgDGAT1A的异源表达能够有效增加种子内的脂肪酸含量，是一个优异的提高含油量的靶基因。

本试验在前期培育获得的VgDGAT1A转基因大豆材料基础上，重点对高代转基因大豆材料进行表型分析，通过实时荧光定量PCR检测VgDGAT1A基因在这些高代大豆材料中表达情况。取成熟的转基因大豆种子进行总脂肪酸提取，分析VgDGAT1A对种子总油脂含量及其他表型的影响，鉴定获得含油量平均提高5.1%的高油大豆品系。本研究为全面理解大豆油脂合成积累机制及调控网络提供了新知识，亦为改良高油大豆品种提供可靠的理论与种质资源。

1　材料与方法

1.1　材料

本试验转基因大豆的二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT1A)基因从斑鸠菊发育种子中克隆所得。本试验所检测的转基因大豆高代材料(种子特异表达VgDGAT1A)由山西农业大学分子农业与生物能源研究所培育保存。转VgDGAT1A基因大豆种植于山西农业大学农作站网室，待植株长至4周龄(4～6片真叶)，取顶端叶片迅速放于液氮中冷冻，然后冷冻保存，以待阳性植株实验。在阳性植株生长后期，取开花后(day after flowering，DFA)30天(30 d)大豆种子经液氮处理后，存于-80 ℃冰箱保存用于定量表达分析，取大豆成熟种子用于提取油脂。

1.2　转VgDGAT1A基因大豆阳性植株检测

本文以4周龄的大豆幼苗(4～6片真叶)为试验对象，采取改良版的CTAB法提取叶片DNA，然后进行PCR扩增，检测外源VgDGAT1A基因。用primer5.0引物设计软件设计引物(表1)，设计时应避免引物二聚体的出现，引物由TSINGKE Biological Technology公司合成。用2×Taq PCR StarMix with Loading Dye试剂盒(Genstar公司)进行PCR检测(反应体系共20 μL，正向和反向引物各1 μL(表1中VgDGAT1A引物，10 nmol·L-1)，10 μL 2×Taq PCR StarMix混合，1 μL DNA(100 μg·mL-1)，7 μL ddH2O，反应在96孔板内进行)。PCR反应程序为：94 ℃ 2min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环，然后利用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1阳性VgDGAT1A植株检测及其qRT-PCR引物

Table1Primers of qRT-PCR of assays in positiveVgDGAT1A-transgnicsoybeans

引物Primer序列/5’→3’VgDGAT1A-FTGCGACTCATACAGGATTCAACVgDGAT1A-RAAATGTGTCCCTTGGGTTTGTqRT-PCR-FCCACTTGCTGCCTACATTqRT-PCR-RCGAGACGCCTGATAGAACGmActin-FAAGCTGTTCTCTCCTTGTACGCCGmActin-RGCACAGTGTGAGACACACCATCA

1.3　VgDGAT1A在转基因大豆中的异源表达分析

本试验使用Total RNA Extractor试剂盒(BBI Life Science公司)提取总RNA。取大豆种子中期进行取样，在液氮中充分研磨，然后进行总RNA的提取。将所得到的RNA溶液置于-80 ℃保存。使用cDNA Synthesis Kit 反转录试剂盒(Genstar公司)获得cDNA。用2×增强型染料实时荧光定量PCR 预混液(GenStar公司)进行qRT-PCR(反应体系共50 μL，正向和反向引物各1 μL(表1中qRT-PCR引物，10 nmol·L-1)，25 μL 2×RealStar Green Power Mixture混合，1 μL cDNA(100 μg·mL-1)，1 μL ROX Reference Dye(50×)，21 μL RNase-free H2O，反应在96孔板内进行)。内参引物见表1中GmActin。反应程序为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 1min，72 ℃ 30 s，40个循环。以大豆管家基因Actin做内参，采用2-ΔΔCq来计算目的基因相对表达水平。

1.4　大豆总脂肪酸提取

利用分析天平分别准确称取50 mg粗研的野生型大豆Jack和转基因大豆种子粉末，加入石英砂后充分研磨，研磨后置于50 mL离心管中，加入7.5 mL甲醇∶氯仿(2∶1)溶液，置于37 ℃的摇床抽提24 h，离心后收集上层有机相，剩余的样品残渣再加入7.5 mL甲醇∶氯仿(2∶1)溶液重复抽提12 h并离心收集上层有机相，同理进行第3次抽提后合并3次的有机相。加入5 mL氯仿，9 mL 1%的NaCl溶液，使得最后甲醇∶氯仿∶H2O为2∶2∶1.8，混匀后8 000 r·min-1离心10 min，收集下层有机相到称重的玻璃管中，氮气吹干后称出玻璃管及脂肪酸的总重量。每个样品3次重复。计算方法：总脂含量=(提取后总重-提取前管重)/0.05。

2　结果与分析

2.1　转VgDGAT1A基因大豆阳性植株的检测

以大豆核基因组DNA为模板，PCR检测转VgDGAT1A基因的阳性大豆植株，凝胶电泳分离PCR产物(图1)，在第5代材料中，共检测大豆植株2 000株，检测出阳性植株有1 578株，检测通过率78.9%，后续实验选用检测出的VgDGAT1A稳定整合的第6或第7阳性大豆品系。

图1　VgDGAT1A转基因大豆PCR检测。Fig.1　The PCR test for VgDGAIT DNA in the transgenic soybeans注：VgDGAT1A基因片段是1 828 bp，图中“+”为阳性质粒上的目的基因，“-”代表非转基因野生大豆，图中“1～22”代表转基因植株Note:The PCR amplification fragment of VgDGAT1A is 1 828 bp. "+" represents target fragment from positive plasmid, "-" represents wild soybean, "1～22" represents transgenic soybean plants

2.2　VgDGAT1A在大豆种子中的表达分析

检测发育种子总RNA提取质量显示，A260/280范围在1.97～2.01，条带分明，没有明显的弥散带，质量好，可以用于后续cDNA第一链合成及qRT-PCR试验。以野生型大豆Jack为对照，对转VgDGAT1A基因大豆种子发育中期阶段样品进行荧光定量检测(图2)。比较发现，VgDGAT1A基因在大豆种子发育中期高量表达。可见外源基因VgDGAT1A已经在大豆中稳定高效表达。

图2　qRT-PCR检测大豆种子发育中期VgDGAT1A基因表达Fig.2　Expression of VgDGAT1A gene by qRT-PCR during mid-period of soybean seed mature process. 注：“Jack”为野生型大豆，“1～4”为转VgDGAT1A大豆不同品系Note:“Jack” represents wild-type soybean and "1～4" represents transgenic VgDGAT1A different soybean lines

2.3　VgDGAT1A转基因大豆种子总油脂含量分析

对7个VgDGAT1A转基因大豆品系和非转基因的野生型大豆Jack大豆种子油脂含量测定结果(图3)显示，转VgDGAT1A基因大豆与野生型(Jack)品种相比，总脂含量均有明显提高(4%～9%)，平均提高了5.1%。检测结果表明，外源VgDGAT1A基因转入大豆并高效表达，编码形成的DGAT1酶蛋白能正常行驶功能，且显著增加大豆总油脂(TAG)含量。观察转基因和非转基因大豆种子形态，未见差异(图4)。

图3　转VgDGAT1A大豆与野生型Jack种子油含量Fig.3　Content of seed oil of transgenic and wild-type Jack seed注：“Jack”为野生型大豆，“1～7”为转VgDGAT1A大豆不同品系。Note:"Jack"representy wild-type soybean,"1～7" represents transgenic VgDGAT1A different soybean lines.

图4　转VgDGAT1A大豆与野生型Jack种子表型对比Fig.4　Comparison of phenotypes of seeds of VgDGAT1A and wild type seeds of Jack

3　讨论与结论

早前研究表明，DGAT表达与大豆种子油脂积累速率之间表现出强烈的正相关性[13]。在发育的种子中，DGAT活性的逐渐增强引发了油脂快速积累，DGAT活性逐渐降低的同时油脂含量也逐步稳定[14]。油菜BnDGAT1超表达能显著提高种子总脂肪酸含量[15]。对蓖麻 DGATs 的研究表明，在蓖麻种子油脂的累积高峰期，DGAT1活性增强，油脂含量显著增加[16]。本文对VgDGAT1A转基因大豆阳性植株鉴定表明，经过多年种植，高代转VgDGAT1A基因大豆仍然呈现整合的VgDGAT1A基因稳定遗传。qRT-PCR分析表明，VgDGAT1A基因在大豆种子发育中期的表达量高，VgDGAT1A基因编码的DGAT1亦可正常行使功能，促进TAG合成，导致转VgDGAT1A基因大豆种子含油量显著提高。本文对高代转VgDGAT1A基因大豆种子表型检测与分析，再次证实VgDGAT1A是一个优异的提高种子含油量的基因，亦可用于其他油料作物油脂含量和品质的遗传改良。

植物油脂代谢是一个由多基因参与的，涉及各蛋白酶协同表达和共同运作的高度精密调控的生化过程。Vanhercke 观察到当DGAT1和WRI1共同浸入本氏烟草叶中时，对TAG积累有显着的协同效应，在烟草中通过WRI1与DGAT1 基因协同表达，在油脂含量提升的同时，脂肪酸成分也出现变化，多不饱和脂肪酸含量下降，同时单不饱和脂肪酸含量上升[17]。丁健等发现沙棘果肉高油脂积累源于源基因“GPD1”和汇基因“DGAT1和DGAT2”的协同高表达[18]。崔琴琴发现FAD2和DGAT2共表达能够提高油桐的含油量，同时少量提高亚油酸含量[19]。各种油料作物的DGAT基因研究的逐渐深入，以及更多与植物油脂代谢相关基因的发现，对提高植物油产量和品质具有重要意义。