HPLC法测定畜禽肉中喹诺酮类多种药物残留

刘海琴

（鹤壁市畜产品质量监测检验中心，河南鹤壁 458000）

1 方法原理

畜禽肉（鸡肉）中残留的氟喹诺酮类药物（环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星）用磷酸盐缓冲液提取，经HLB固相萃取柱净化，流动相洗脱后。用液相色谱-荧光检测器测定，外标法定量。

2 仪器与试剂

安捷伦1100液相色谱仪-配荧光检测器，

分析天平 感量0.00001g.

R-201旋转蒸发仪，

VX-2涡旋振荡器，

Eppendorf移液器（成套），3～30k高速冷冻离心机，固相萃取装置， HLB固相萃取柱.

3 实验部分

3.1 试剂的配制

（1）磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钾6.8g，加水溶解并稀释500ml，用5.0mcl/ml氢氧化钠溶液调节（pH=7.0）

（2）磷酸/三乙胺溶液（0.05mcl/l）取85%磷酸3.4 ml，用水稀释至1000ml，用三乙胺调节pH=2.4.

3.2 标准工作液的配制

（1）分别称取盐酸环丙沙星、甲磺酸达氟沙星、恩诺沙星、盐酸沙拉沙星对照品各约25mg，精密称定，分别于25ml棕色容量瓶中，用0.03mcl/l氢氧化钠溶液稀释成浓度分别为1mg/ml的储备液。（达氟沙星储备液浓度配制成0.2mg/ml）

（2）混合标准中间液 分别量取1mg/ml（0.2mg/ml）的储备液各0.1ml于50ml容量瓶中，用流动相稀释成浓度为2µg/ml（0.4ug/ml）的混合标准中间液。

3.3 方法步骤

3.3.1 质量控制样品的制备

（1）空白样品：取空白试样，与待测样品同步处理。

（2）添加样品：取空白样品，添加2µg/ml（0.4µg/ml）的混合标准中间液0.1ml，制的浓度为100µg/kg的阳性添加试料，与待测样品同步处理。

3.3.2 提取

（1）取匀浆的试料2±0.02g，置50ml离心管中，加磷酸盐缓冲液10.0ml，涡旋混合，中速震荡5min，14000r/min离心10min，倾取上清液。（磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钾6.8g，加水溶解并稀释500ml，用5.0mcl/ml氢氧化钠溶液调节pH=7.0）

（2）用磷酸盐缓冲液10.0ml重复提取一次。合并两次上清液，备用。

3.3.3 净化

（1）固相萃取柱依次用甲醇2ml，磷酸盐缓冲液2ml预洗。

（2）取上述备用液体5.0ml过柱。

（3）用水2ml洗柱，挤干。

（4）用流动相2.0ml洗脱，收集，挤干，涡旋混合。过0.22µm微孔滤膜，供上机测定。

3.3.4 系列标准工作液的制备

精密量取混合标准中间工作液，用流动相稀释成浓度为5、

10、20、50 、100、200、500ng/ml的系列标准工作液。系列标准工作溶液按表1配制。

表1 系列标准工作溶液配制

3.4 仪器色谱条件

色谱柱：C18（4.6×150mm 5µm）；

柱温：30℃；

流动相：0.05mcl/l磷酸溶液/三乙胺-乙腈（87+13）；

流速：1.0ml/min；

进样量：20µl；

检测波长：激发波长280nm；发射波长450nm。

20ng/ml 标准溶液中氟喹诺酮类药物色谱图

100μg/kg空白鸡肉添加试样中氟喹诺酮类药物色谱图

3.5 结果分析

3.5.1 线性范围

取浓度为5～500ng/ml 氟喹诺酮类药物系列标准工作液进样，以峰面积为纵坐标，以药物浓度为横坐标绘制标准工作曲线。结果表明（见表1），在5～500ng/ml系列标准工作液浓度范围内，喹诺酮类药物峰面积与浓度呈良好的线性关系。

表2 喹诺酮类药物的线性方程、相关系数

3.5.2 准确度和精密度的测定

称取同一来源的空白鸡肉样品3份，每份2.0g，分别添加2µg/ml（0.4µg/ml）的喹诺酮类药物溶液0.1ml，制备浓度为100µg/kg（达氟沙星20µg/kg）的阳性样品，按本方法测定，计算回收率在73.1%～84.54%，标准偏差在1.84%～5.4%，表明本方法重复性较好，具体结果见表3。

表3 喹诺酮类药物的回收率试验结果

4 实验结论

实验表明，鸡肉样品经磷酸盐缓冲液提取后，经固相萃取柱净化后，采用液相-荧光检测器法测定，外标法定量，回收率为73.1%～84.5%，相对标准偏差为1.8%～5.4%（n=3）.本方法系列标准工作液浓度范围内，喹诺酮类药物峰面积与浓度呈良好的线性关系，准确度好、近年以来经过对各类动物组织检测的结果表明，该方法具有简便、快速、灵敏、准确的特点，可满足市级检测单位对动物组织中4种喹诺酮类药物残留日常检测需要。