新疆南疆农田防护林主要树种腐烂病病原鉴定

郭开发,赵思峰,吴彩兰,艾尼古丽·依明

(新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室/石河子大学农学院,新疆 石河子 832003)

农田防护林是由树木组成的具有多种功能的人工廊带网络系统,对改善农田小气候,减轻和防御各种自然灾害,保证农业稳产、高产作用明显。在西北干旱地区,改善林带小气候,是农田防护林的主要作用,其次在防风固沙、增加生物多样性、净化空气、碳汇和保障作物稳产高产等方面起到重要作用[1-2]。新疆南疆主要造林树种有新疆杨Populusalbacv.pyramidalis、箭杆杨P.nigracv.Afghanica、柳树Salixmatsudana、榆树Ulmuspumila、胡杨Populuseuphratica等,这些树种具有生长快、耐干旱、耐寒冷、防护效益高等优点。但因缺水干旱、单一种植、经营管理粗放、防治措施不当等,新疆农田防护林腐烂病危害严重,防护林的可持续效益和生态环境屏障功能受到严重制约。克热曼 等[3]对克拉玛依市林木病害进行了调查,结果表明杨树Populusspp.、榆树 、柳树、白蜡Fraxinuschinensis、沙枣Elaeagnusangustifolia、卫矛Euonymusalatus等林木均有腐烂病的发生,其中杨树腐烂病发生程度最为严重。作者2012—2015年采集南疆农田防护林主要树种腐烂病样品 ,采用形态学特征结合分子生物学技术,对南疆农田防护林主要树种腐烂病的病原菌进行了鉴定,以期为今后有效防治该病提供依据。

1 材料与方法

1.1 感病样本采集 从新疆杨、箭杆杨、胡杨、柳树4种主要树种上采集腐烂病样本52份(表1)。所采集的枝条样品均表面有黑色的分生孢子器,分生孢子器上产生卷须状黄色或粉红色分生孢子角。

1.2 病原菌分离与致病性测定

1.2.1 分离与纯化 病原菌采用常规组织分离法分离[4]。先在 PDA 培养基上进行分离,待分离物长出后,在WA培养基上进行单孢纯化,获得的菌株保存在试管PDA 斜面上,置于4 ℃ 冰箱中保存备用。

1.2.2 致病性测定 采用离体枝条接种法[5]进行致病性测定。选择 1 a生健康林木新鲜枝条,截成约20 cm长小段,先用自来水冲洗后,再用 0.1% HgCl2浸泡 1 min,然后用无菌水冲洗、晾干,枝条两端用保鲜膜将保湿脱脂棉包裹。用铁钉钉帽 (直径 7 mm)加热后烫伤枝条树皮,以菌丝块 (直径7 mm) 接种在烫伤部位,用保鲜膜将其包裹。每个分离物接种 5 段枝条,每段枝条接种 2 处,以无菌 PDA 饼作为空白对照。接种枝条放置于白瓷盘,在28 ℃光照培养箱中发育,接种 7 d 后观察、记录枝条发病情况,并对发病枝条进行再分离。

1.3 病原菌鉴定

1.3.1 形态学鉴定 将供试菌株接种在离体林木枝条上,待其产生分生孢子器后,用双面刀片切片,制成玻片后在生物显微镜下观察纵、横切面形态特征,并测量分生孢子大小,记录并拍照[6-7]。

1.3.2 分子生物学鉴定 依据形态学鉴定结果,挑选部分代表菌株在 PDA 平板上培养 5 d后,采用Lee等[8]的方法提取菌丝基因组DNA。借鉴Peever 等[9]的方法,用通用引物ITS1和ITS4扩增代表菌株的ITS和5.8S rDNA,用引物Beta-2a和Beta-2b扩增代表菌株的β-tubulin 基因。PCR反应体系:PCR TaqMix 12.5 μL、10 μmol/L ITS1/ Beta-2a 1 μL、10 μmol/L ITS4/ Beta-2b 1 μL、基因组 DNA 0.5 μL、ddH2O 10 μL至终体积为 25 μL。ITS 序列 PCR 扩增反应程序为94 ℃ 预变性 4 min,然后94 ℃变性 30 s,55 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 40 s,共30个循环,最后72 ℃延伸 10 min;β-tubulin基因 PCR 扩增反应程序:94 ℃预变性 4 min,然后 94 ℃变性 30 s,58 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 40 s,共 30 个循环,最后 72 ℃ 延伸 10 min。反应完成后,1 % 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 反应产物。

将不同引物PCR 反应产物进一步纯化后,送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行基因测序。测序后的序列经校正后,在GenBank 中进行同源序列搜索( BLAST搜索),比较测试菌株同现有数据库中相应序列的同源程度。用 MEGA 5 软件进行比对并构建系统树,应用自展(bootstrap)检验系统树,自展数据集为1 000次。

2 结果与分析

2.1 病原菌致病性 人工离体接种1～2 a生新鲜林木枝条后,各分离菌株均可导致林木枝条发病。接种 7 d 后接种部位出现褐色、水浸状病斑。随后病斑沿接种部位扩展呈圆形。离体枝条病斑部位表皮皱缩,病健交界明显(图1)。接种 20 d 后,病斑表皮皱缩,且产生大量黑色小点,室温条件下溢出黄色分生孢子角,对发病组织进行再分离,均可获得相应的接种菌株。对照枝条上未出现症状。

图1 腐烂病菌致病性测定结果

2.2 病原菌鉴定

2.2.1 形态学鉴定 从新疆南疆农田防护林腐烂病样品中共分离获得了52个菌株。其中新疆杨分离得到6株,箭杆杨17株,胡杨12株,柳树17株。鉴定出3种病原菌,分别是金黄壳囊孢Cytosporachrysosperma(有性型:Valsasordida),Cytosphoranivea(有性型:Leucostomaniveum)和Cryptosphaeriapullmanensis,由于腐烂病病原菌在新疆主要以无性世代存在,得到的52个菌株均为无性型(表1)。

表1 新疆南疆农田防护林主要树种腐烂病病原菌分离结果

2.2.2 分子生物学鉴定 用真菌通用引物ITS1/ITS4在供试菌株中均可以扩增到550 bp 大小的片段,将PCR扩增得到的ITS序列测序,在GenBank 中比对发现菌株的ITS序列分别和V.sordida,L.niveum和Cryptosphaeriapullmanensis的相似度最高。选择代表性的11个菌株与11个从GenBank下载的序列(3个V.sordida序列、2个L.niveum序列、2个V.mali序列、2个Cryptosphaeriapullmanensis序列、1个Cryptosphaerialigniota序列和外群Alternariasp.序列)共22个序列构建系统发育树。其中7个菌株和V.sordida聚为一枝,自展支持率达到93%;2个菌株和L.niveum聚在一枝,2个菌株和Cryptosphaeriapullmanensis在同一个分支,自展支持率均达到93%以上(图2)。

用真菌引物Beta-2a/Beta-2b在供试菌株中均可以扩增到500 bp 大小的片段,将PCR扩增得到的ITS序列测序,在GenBank 中比对发现菌株的β-tubulin序列分别和V.sordida,L.niveum和Cryptosphaeriapullmanensis的相似度最高。选择代表性的11个菌株与11个从GenBank下载的序列(3个V.sordida序列、2个L.niveum序列、2个V.mali序列、2个Cryptosphaeriapullmanensis序列、1个Cryptosphhaeriamulticontinentalis序列和外群Alternariasp.序列)共22个序列构建系统发育树。其中7个菌株和V.sordida聚为一枝,自展支持率达到96%;2个菌株和L.niveum聚在一枝,2个菌株和Cryptosphaeriapullmanensis在同一个分支(图3)。

图2 基于ITS序列构建的腐烂病菌及该属其它真菌的系统发育树

3 结论与讨论

对新疆南疆农田防护林主要树种腐烂病样品进行了病原菌分离,采用形态学和分子生物学技术对分离菌株进行种类鉴定和致病性测定,结果表明引起新疆南疆农田防护林主要树种腐烂病的病原菌有金黄壳囊孢C.chrysosperma,C.nivea和Cryptosphaeriapullmanensis,其中C.chrysosperma是主要种。Cryptosphaeriapullmanensis在国内鲜有报道,在胡杨上属首次发现。

国内外对防护林的研究主要集中在其所产生的生态效益、经济效益和社会效益[10]。防护林的生态效益研究主要集中在防护林的农田小气候效应及其对土壤结构、养分的改良作用[11],而目前对防护林病害的报道较少,因此加强新疆农田防护林病害的研究并以此为依据开展病害防治是维护新疆农业生产和生态平衡的新任务。

壳囊孢属Cytospora真菌是引起树木腐烂病的重要病原,其有性型是黑腐皮壳属Valsa。危害新疆农田防护林的腐烂病病原菌均为无性型,未发现有性型。新疆农田防护林主要树种是杨柳科林木,而引起杨柳科林木腐烂病的病原物主要有Cytosporaatrocirrhata[12],Cytosporachrysosperma[13],C.germanica[14],C.kantschavelii[15],C.tritici[16]。在我国西北、华北及东北地区,Valsasordida被认为是引起杨树腐烂病的主要病原菌,主要危害杨树、柳树、桉树、榆树等树种[17-18]。杨明秀[19]从各地杨树、柳树、核桃等多种寄主均可分离得到C.chrysosperma,且致病性与寄主有关,即在杨树上分离的病原菌对杨树的致病性强于非杨树寄主,但与地理位置无明显关系。

腐烂病已成为新疆林木主要病害之一。在新疆南疆地区果园腐烂病发生严重,受害严重果园发病率达 70 %～90 %,可导致整园衰亡,腐烂病已对新疆林果生产和发展造成严重威胁[20]。在阿勒泰地区,腐烂病危害人工种植的北京杨、俄罗斯杨、新疆杨、速生杨等杨属树种,发病率可达 90%以上[21]。本研究明确了新疆南疆农田防护林腐烂病的病原菌种类,将为农田防护林腐烂病的防治提供一定指导。

图3 基于Beta-Tubulin序列构建的腐烂病菌及该属其它真菌的系统发育树