补肾解毒通络方对类风湿关节炎患者血清中血管新生相关因子的影响*

何奕坤，杨光辉，郑玥琪，张 凯，吴辉辉，潘 新，胥晓芳，姚静慧

（上海中医药大学附属曙光医院风湿免疫科，上海 200021）

类风湿关节炎（RA）是一种以关节滑膜受累为主要特征表现的系统性自身免疫性疾病，而血管翳的形成是引起RA滑膜病变的重要因素，在RA软骨和骨破坏过程中发挥重要作用。血管翳主要是由RA滑膜中新生的血管形成，这些新生血管受到促血管新生相关因子调控发挥作用。本研究采用本科室治疗RA的有效用方补肾解毒通络方，以活动期RA患者血清中血管新生相关因子：血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）以及转化生长因子-β1（TGF-β1）为研究对象，观察治疗前后血管新生相关因子的水平变化，以明确该方对新生血管的作用机制，现报告如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 所观察病例均来自2016年1月—

2017年12月本科门诊的活动期RA患者，共78例。按随机数字表法随机分为治疗组（n=38）和对照组（n=40）。治疗组中男9例，女29例，平均年龄（48.14±10.24）岁，平均病程（10.51±6.98）a。对照组中男 12例，女 28例，平均年龄（49.59±11.78）岁，平均病程（11.01±6.58）a。两组患者在性别、年龄、病程方面无统计学差异（P＞0.05）。

1.2 诊断标准

1.2.1 RA西医诊断标准 参照2009年美国风湿病学会（ACR）及欧洲抗风湿协会（EULAR）[1]对于RA的诊断标准。

1.2.2 活动期RA诊断标准判断 采用EULAR的DAS28 标准[2]，DAS28 评分＜2.6 为缓解，2.6～3.2 分为低度活动，＞3.2分且≤5.1分为中度活动，＞5.1分为高度活动。

1.3 纳入标准 1）符合活动期RA病例选择标准。2）中医辨证为肾虚毒邪络阻证。3）年龄小于70岁。4）签署知情同意书，自愿接受临床试验。

1.4 排除标准 1）不符合上述纳入标准者。2）伴有肺间质病变或严重肝酶升高者。3）妊娠期、哺乳期女性或近期准备生育者。4）对试验药物过敏或过敏体质者。5）合并心、脑、肝、肾、内分泌系统和造血系统等严重原发性疾病、精神病患者。6）重叠其他风湿性疾病如系统性红斑狼疮、干燥综合征、肌炎等。

2 治疗方法

2.1 对照组 甲氨蝶呤（MTX）片（上海信谊药业有限公司，国药准字 H31020644，规格：2.5 mg×100片/瓶）每周1次，每次15 mg，口服。

2.2 治疗组 在对照组基础上加用补肾解毒通络方（仙茅 15 g，淫羊藿 15 g，续断 15 g，青风藤 15 g，忍冬藤 30 g，肿节风 30 g，生地 15 g，片姜黄 15 g，羌活 9 g，牡丹皮 9 g，赤芍 9 g，全蝎 3 g，乌梢蛇 9 g，生甘草6g），该方由本院中药房提供并代煎，每日2次，每次200 mL。两组均以6个月为1个疗程。治疗期间如关节疼痛明显可加用非甾体抗炎药（NSAID）。

3 疗效观察

3.1 指标 ①安全指标：血常规、尿常规，肝肾功能，心电图。②疗效指标：VAS评分、DAS28、HAQ、中医证候疗效比较。③实验室指标：CRP、ESR。以上指标治疗前后各记录1次，其中安全指标每两个月记录1次。

3.2 血管新生相关因子检测指标 取两组患者治疗前后的血清，以酶联免疫吸附双抗夹心法（ELISA）检测VEGF、bFGF、TGF-β1水平。根据试剂盒提供的说明书进行操作，每个样本和标准品均设复孔。以上指标治疗前后各记录1次。

3.3 统计方法 使用SPSS 18.0处理。计量资料服从正态分布的用均值±标准差（±s）表示，同组前后比较用配对t检验，组间比较用独立样本t检验；偏态资料选用非参数检验进行比较，采用中位数、四分位数间距、平均秩次进行描述，组内前后比较采用Wilcoxon符号秩和检验，组间比较采用两独立样本Wilcoxon检验。计数资料用卡方检验。

4 结果

两组观察6个月后，对照组脱落5例，均为未能坚持治疗，治疗组脱落3例，2例为未能坚持规范治疗，1例因出现胃脘部不适而自行停药。对照组进入统计患者为35例，治疗组为35例。

4.1 两组治疗前后VAS及DAS28评分的比较 治疗前，DAS28评分均值提示两组均处于病情中高度活动度，两组间VAS评分、DAS28评分比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。治疗后，组间内VAS评分、DAS28评分比较差异均有统计学意义（P＜0.05），且治疗组的均值均低于对照组，提示治疗组在改善VAS及DAS28评分方面优于对照组，且两组治疗前后比较差异均有统计学意义（P＜0.05），提示经治疗，两组的VAS评分显著下降，两组治疗方法对控制疾病活动度有效。见表1。

表1 两组治疗前后VAS、DAS8评分比较（±s）Tab.1 Comparison of VAS and DAS8 score between two groups（±s）

表1 两组治疗前后VAS、DAS8评分比较（±s）Tab.1 Comparison of VAS and DAS8 score between two groups（±s）

注：与本组治疗前比较，*P＜0.001，与对照组治疗后比较，#P＜0.05。

组别对照组治疗组例数35 35 VAS评分 DAS28评分治疗前 治疗后 治疗前 治疗后3.95±0.93 2.59±0.69* 5.45±0.80 3.69±0.65*3.88±0.99 1.99±0.63*# 5.38±0.92 3.09±0.76*#

4.2 两组治疗前后中医证候疗效的比较 治疗后治疗组中医证候疗效的有效率为84.00%，对照组有效率为48.15%，两组间显效率比较，差异具有统计学意义（P<0.05），表明治疗组中医证候疗效优于对照组。见表2。

表2 两组中医证候疗效比较Tab.2 Comparison of TCM symptoms effect between two groups例（%）

4.3 两组治疗前后CRP、ESR的比较 两组组内比较，经配对Wilcoxon秩检验，CRP比较差异均有统计学意义（P＜0.05），提示经治疗，两组的CRP水平降低。而ESR比较差异均无统计学意义（P＞0.05），提示两组治疗对改善ESR水平无明显疗效。治疗后，两组组间比较，经成组设计两样本比较的Wilcoxon秩检验，结果显示：两组间CRP比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示治疗组疗效优于对照组，而ESR组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表 3 两组 CRP、ESR 比较 [M（Q1，Q2）]Tab.3 Comparsion of CRP/ESR between two groups[M（Q1，Q2）]

4.4 两组治疗前后血清中血管新生相关因子水平的比较 治疗前两组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性；治疗后，在对 VEGF、bFGF 的影响方面，两组治疗后水平均较治疗前明显降低，具有统计学意义（P＜0.05）；治疗组较对照组明显降低，具有统计学意义（P＜0.05）。在对TGF-β1的影响方面，治疗组均较治疗前水平明显升高，具有统计学意义（P＜0.05）；对照组均较治疗前水平升高，但无统计学意义（P＞0.05）；治疗组较对照组明显升高，具有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

4.5 不良事件 治疗期间治疗组无不良事件，对照组出现1例不良事件，为轻度肝酶升高，经保肝降酶对症处理后肝功能恢复正常，未影响试验过程。

5 讨论

RA是一种以滑膜炎为主要特征的系统性自身免疫性疾病。新生血管在RA的发生发展中起着重要作用[4]。血管新生发生在滑膜增生的早期阶段，血管因子调节血管新生的产生，为滑膜细胞提供营养物质，同时也可以促进炎性因子的产生，导致RA后期的骨破坏。在众多的血管新生相关因子中，VEGF、bFGF、TGF-β1是目前已知作用较强的促血管生成因子。

在调节血管增生的细胞因子中VEGF具有重要的地位[3]。研究表明在RA患者血清及关节滑膜液中VEGF表达显著增高[4]，此外，据报道，VEGF的缺乏，可减轻胶原诱导关节炎大鼠的滑膜炎症和血管生成[5]。而另一种强有力的促血管新生因子bFGF是内皮细胞有丝分裂素，它具有与VEGF同样的促血管新生的作用，其发挥作用的主要途径是增加微血管通透性，对微血管有促进生长作用，加重滑膜炎症，研究显示，在佐剂关节炎大鼠滑膜中bFGF可呈现过度表达[6]，另有研究发现在RA患者血清、滑膜中bFGF的表达水平明显高于正常人群[7]。TGF-β1在RA的血管生长中亦发挥着重要作用，TGF-β1是一种强力趋化因子，它能够促进炎症细胞趋化，调节内皮细胞生长，吸引成纤维细胞和巨噬细胞聚集，促进VEGF、bFGF的释放，三者可共同促进血管新生。研究发现[8]TGF-β1在活动期RA患者的血清中低于正常，这是因为在活动期时TGF-β1以潜在形式入侵到关节的滑膜内，导致血清中TGF-β1下降，使得自身免疫反应异常，其水平下降导致RA患者调节免疫活动的能力下降，从而发挥负面生物学作用，通过本研究发现活动期RA患者血清中VEGF、bFGF明显增高，而TGF-β1水平则降低，这与以上相关研究结果相一致。

本研究用补肾解毒通络方治疗活动期RA患者，方中由仙茅、淫羊藿、川续断补肾强骨，此以二仙汤为补肾基础，强肾而无燥热之偏，益精无凝滞之嫌。配以全蝎归肝经，有祛风通络止痛的功效，可与乌梢蛇联用，蛇善走窜，有搜风通络的功效，此二药联用，加强通络止痛的功效；同时青风藤配合肿节风，加强祛风除湿之余，佐以清热解毒之功效。佐以片姜黄、赤芍、牡丹皮等活血药物，帮助除瘀，防止瘀血内停所导致痹证迁延不愈。全方配伍，兼顾补肾、解毒、通络三法，在本研究中也取得较好疗效，在联合MTX治疗活动期RA患者，并通过与单药MTX相比，共观察70例活动期RA患者，结果显示治疗组能够降低VAS及DAS28评分，且改善中医证候疗效，同时降低CRP，均优于对照组；在ESR方面，治疗组治疗后虽低于对照组，但下降幅度不大，无统计学意义，分析其原因，可能与观察时间短有关，因为ESR本身下降幅度慢，同时在研究过程中，影响ESR的因素较多，包括与贫血、高球蛋白血症等相关。本试验中治疗组未发生不良反应，提示治疗组可以有效缓解临床症状、控制疾病活动度，安全性高。

在既往研究文献中发现，补肾解毒通络方中所包含的中药可影响血管新生相关因子，其中片姜黄中主要有效成分姜黄素能有效抑制VEGF及其受体的表达，降低佐剂关节炎大鼠血清血管内皮生长因子水平[9]。青风藤的有效成分青藤碱可抑制bFGF诱导的人脐静脉内皮细胞的增殖、趋化性迁移和管腔形成，同时降低体内基质胶栓子中的血管新生和大鼠主动脉环实验中的微血管生长[10]。方中其他中药提取物，如牡丹皮、赤芍、黄芩在其他疾病研究领域也被证实可抑制血管新生[11-13]。因此，鉴于血管新生因子在RA中的重要作用，本研究观察补肾解毒通络方对于RA患者血清中血管新生相关因子VEGF、bFGF以及TGF-β1水平来探索该方对RA血管翳的生成可能存在的作用机制。本研究证实：治疗后，治疗组患者血清VEGF、bFGF较治疗前水平明显降低（P＜0.05），TGF-β1 较治疗前明显升高（P＜0.05）；对照组患者血清VEGF、bFGF较治疗前水平降低（P＜0.05），TGF-β1较治疗前升高，但无统计学差异（P＞0.05），两组相比，治疗组在对VEGF、bFGF的影响作用上均较对照组明显降低（P＜0.05），在对TGF-β1较对照组则明显升高（P＜0.05）。通过以上结论可说明补肾解毒通络方联合MTX较单药MTX在对RA中的促血管新生相关因子的疗效更显著，说明补肾解毒通络方可通过下调VEGF、bFGF，并上调TGF-β1的表达水平从而抑制RA新生血管增生，表明该方在对RA血管翳的形成可能具有一定的抑制作用。通过本研究项目的实施，为今后更加深入研究该方对RA滑膜病变的影响奠定了基础。

表4 两组治疗前后血清中血管新生相关因子水平的比较（±s）Tab.4 Comparison of angiogenic growth correlation factor lever in serum before and after treatment between two groups（x± s）

表4 两组治疗前后血清中血管新生相关因子水平的比较（±s）Tab.4 Comparison of angiogenic growth correlation factor lever in serum before and after treatment between two groups（x± s）

注：与本组治疗前比较，*P＜0.05；与对照组治疗后比较，#P＜0.05。

组别bFGF（pg/mL）VEGF（pg/mL）TGF-β1（ng/mL）271.27±63.57 131.27±24.62*# 33.10±11.27 18.87±5.13*# 18.13±11.26 30.21±15.09*#治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后治疗组对照组例数35 35263.68±59.69 179.53±46.75* 32.88±12.0324.15±9.87*16.97±11.12 19.89±12.78

（收稿日期：2018-05-16）