一款胶囊产品提高机体免疫活性及抗肿瘤功能活性研究

2018-11-02 05:28李德灵

中国食品工业 2018年6期

李德灵

无限极（中国）有限公司

1.前言

近年来，我国工业化进程的加速，环境污染加剧以及快速的生活节奏和与日俱增的生存压力，导致各种慢性疾病的患病率越来越高。以癌症为例，2017年的癌症统计资料显示，在中国，每年新发癌症病例达 429 万，占全球新发病例的 20% ，死亡 281 万例[1]。癌症防治已成为我国重要公共卫生问题。其实，癌症的发病也是由于人体免疫力下降导致[2]。提高人体免疫能力是抗癌的关键[2]。

我国许多中草药具有提高免疫功能，比如灵芝、薏苡仁、茯苓、白术、菟丝子、黄精、麦冬、甘草和枸杞子等等[3]。市面上有很多提高免疫功能的保健品用其中一种或几种原料制成产品。本实验用的胶囊产品以灵芝、薏苡仁、茯苓、白术、菟丝子、黄精、麦冬、甘草、枸杞子中药材等精制而成。这种复合产品是具具有提高免疫并具有抗肿瘤作用，未见报道。

本实验拟采用动物实验对这一产品的促进免疫功能及抗肿瘤功能进行研究。

2.实验材料与试剂

一款胶囊产品由无限极（中国）有限公司提供。实验动物来自广东省医学实验动物中心。脱纤维绵羊血、Hank's液、ConA 液、RPMI1640培养液、MTT、绵羊红细胞、脱酸脱氢酶基质液和S180细胞株，来自广州齐云生物科技有限公司；异丙醇、Na2CO3、冰醋酸、台酚蓝、NP40和Triton来自广州化学试剂厂。

3.实验方法

3.1 增强免疫功能实验[4]

3.1.1实验动物、剂量分组及受试样品给予时间

取SPF级ICR小鼠252只，雌性，体重18～22 g，分成3批进行试验，分别进行DTH和血清溶血素实验，碳粒廓清实验，小鼠脾淋巴细胞转化实验和NK细胞活性测定实验。每批小鼠均分成5组，每组12只，分别为：阴性对照组，模型对照组，样品低、中、高剂量组（150，300，600mg/kg）。适应性喂养3天后正式试验，连续给药30 d，经口灌胃给予小鼠受试物。

3.1.2 迟发型变态反应

取新鲜的脱纤维羊血，生理盐水洗涤3次（1000 rpm，10 min），每只小鼠腹腔注射2%压积绵羊红细胞（SRBC）0.2 mL，致敏后4 d，测量左后小鼠足趾厚度，同一部位测量三次，取平均值。然后在测量部位用20 μL 20%的SRBC进行第二次免疫，24 h后测量相同部位厚度，计算二次免疫前后足趾厚度差值。

3.1.3 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验

无菌取脾，置于盛有适量（3-5ml）无菌Hank's液平皿中，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗2次，每次离心10 min（1000 r/min）。然后将细胞悬浮于2 mL的完全培养液中，用全自动细胞计数仪计数脾细胞，或用台酚蓝染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度为3×106个/mL。

将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1 mL，一孔加75 μl ConA 液（相当于7.5μg/mL），另一孔作为对照，置5%CO2，37℃孵箱中培养72 h。培养结束前4 h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT（5mg/mL）50 μl /孔，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，超声震荡（2秒）或人工吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570 nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2 mL比色杯中，分光光度计上在波长570 nm测定OD值。

用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。

3.1.4 血清溶血素抗体积数的测定

试验第26-27天，将压积绵羊红细胞（Sheep red blood cells, SRBC）用生理盐水配成2%（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2 mL进行免疫。第31天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，3000 r/min离心10 min，收集血清。取U型底的96孔板每孔加入100 μL PBS缓冲液，然后在第一孔加入100 μL小鼠血清吹打均匀，再从第一孔取100 μL到第二孔吹打均匀，再从第二孔取100 μL到第三孔吹打均匀，以此类推进行2倍稀释，最后一孔取出100 μL弃去，每孔加入100 μL 0.5%(v/v)的SRBC悬液（SA稀释），混匀，放入生化培养箱37℃温箱孵育3 h，观察血球凝集程度，计算抗体积数。

3.1.5 碳粒廓清实验

所有小鼠通过尾静脉注射0.2 mL稀释印度墨汁，计时2、10 min，分别取小鼠内眦静脉血20 μL加入到2 mL0.1%Na2CO3溶液防止发生凝集。以0.1%Na2CO3溶液作空白对照，在600 nm波长处测OD值。t1表示2 min，t2表示10 min，OD1表示2 min所取静脉血的光密度值，OD2表示10 min所取静脉血的光密度值。颈椎脱臼处死小鼠，解剖，取肝脏和脾脏称重记录，按下式计算吞噬指数a。

3.1.6 NK细胞活性测定: 乳酸脱氢酶测定法

实验前24 h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hank's液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。

无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗2次，每次离心10 min（1000r/min）。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5 mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5 mL 2倍Hank’s液及8mL Hank’s液，1000 rpm，10 min离心，然后将细胞悬浮于2 mL的完全培养液中，用全自动细胞计数仪计数脾细胞；或用1 mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1%冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95%以上)，用台酚蓝染色计数活细胞数（应在95%以上），最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。

取靶细胞和效应细胞各100μl（效靶比50:1），加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40或2.5% Triton各100μl ；上述各项均设三个复孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μl置平底96孔培养板中，同时加入乳酸脱氢酶基质液100μl，反应3min，每孔加入1mol/L的HCl 30μl，在酶标仪490nm处测定光密度值（OD）。

按下式计算NK细胞活性，受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，即可判定该项实验结果阳性。

3.2 抗肿瘤功能研究

3.2.1 实验动物、剂量分组及受试样品给予时间

清洁级昆明种小鼠，雄性，18～22g，每组12只，共5组：模型对照组、样品低、中、高剂量组（150、300、600 mg/kg·bw），阴性对照组给予蒸馏水，连续10d，受试物每天定时经口灌胃各剂量组。

3.3.2 抗肿瘤实验

将复苏的S180细胞株（0.2mL/只）接种到昆明种小鼠腹腔内，第7d时选取生长良好的S180肉瘤细胞荷瘤鼠腹水，呈乳白色，按1:4加入无菌生理盐水稀释。同样的方法（0.2mL/只），继续传两代。选取生长良好的第二代荷瘤鼠腹水复制肿瘤动物模型。

无菌抽取6只荷瘤鼠腹水，混合，按1:4加入无菌生理盐水稀释。0.4%台盼蓝染色计数活细胞数，细胞悬液:0.4%台盼蓝=1:9，混匀后染色5min，显微镜下计数活细胞数，然后用无菌生理盐水稀释，调整活肿瘤细胞密度为1×107mL-1（冰浴中操作），按0.2mL/只接种于经常规皮肤消毒后的待接种小鼠右前腋皮下，整个操作于30分钟内完成。

各用药组于造模后24小时开始灌胃给药，模型对照组灌胃蒸馏水。连续10d。末次给药后24h，颈椎脱臼处死小鼠，剥离肿瘤、并取脾脏和胸腺称重，计算各组动物的平均瘤重、抑瘤率、脾脏指数和胸腺指数。

抑瘤率 =（对照组平均瘤重－给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%

脾脏指数 = 脾脏重量 / 体重×100%

胸腺指数 = 胸腺重量 / 体重×100%