抗艰难梭菌毒素纳米抗体在乳酸乳球菌中重组表达及其功能分析

武国松 李杉

（华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006）

艰难梭菌（Clostridium difficile）为革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌，是抗生素药物相关性腹泻的主要致病菌［1-2］；由于近年来抗生素的广泛使用，特别是强毒菌株（027/NAPI/BI）的出现，使得艰难梭菌感染（Clostridium difficileinfection，CDI）在国内外呈上升趋势［3］；CDI常见病症为假膜性结肠炎，外周白细胞明显增多，腹泻，发热等，严重的会出现急性肾衰竭和低血压甚至死亡，复发率高达40%［4］。

目前用万古霉素、非达霉素作为感染的一线治疗方案，然而抗生素药物易进一步破坏肠道微生态，加重菌群失衡，从而引起反复感染［5］。1989年在骆驼的血清中发现一种天然缺失轻链只含有重链的抗体［9］。具有相对分子质量小（分子量只有15 kD左右）、稳定性强、抗原结合性能好、易表达及免疫原性低等特点。这种只由重链可变区构成的单域抗体被称为VHH抗体（Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH）［6］，亦被称为纳米抗体（Nanobody，Nb）。纳米抗体具有多种优势［12-13］，在食品及药物开发等领域拥有广阔的前景。

本实验室已获得了从驼羊血清中分离的抗艰难梭菌毒素的基因E3和AA6，通过短小的连接序列（Linker）将E3及AA6串联在一起，从而转化成二价双特异的形式，相比单价纳米抗体，二价纳米抗体具有更高的抗原识别能力及抗原亲和力［7］。从而增强其对毒素B的抑制效率，为治疗艰难梭菌感染奠定基础。

乳酸菌是治疗性蛋白载体，自身具有免疫佐剂作用，能够在强胃酸环境下生存，不需要对抗原进行复杂的处理。乳酸菌高效表达系统NICE（The nisin controlled expression，NICE）是在乳链菌肽（Nisin）诱导下由 nisA 启动子控制目的基因表达的［8］。nisin可以在含有 nisRK的菌中高度诱导克隆在 nisA启动子之后的基因而自身不会产生内毒素。当在菌的对数生长期时加入微量的 nisin，目的基因的浓度依赖诱导将会发生，且诱导作用与 nisin的浓度在一定范围内成正比，诱导效率可高1 000倍以上［9］。

本研究应用NICE系统构建质粒pNZ8148-E3-AA6，获得重组乳酸乳球菌NZ9000/ pNZ8148-E3-AA6，诱导表达纳米抗体，通过SDS-PAGE 和Western blot鉴定表达产物，亲和层析法纯化目标蛋白，并对所获得重组二价纳米抗体进行初步活性鉴定，可以中和艰难梭菌毒素TcdB的细胞毒性。本研究成功在乳酸乳球菌中表达具有抑制TcdB细胞毒性的纳米抗体，旨在为治疗艰难梭菌感染提供一个潜在方法，具有一定的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和培养基 乳酸乳球菌NZ9000，质粒pNZ8148（氯霉素抗性）由江南大学生物工程学院张娟博士惠赠。M17培养基：购自青岛海博生物技术有限公司；GM17液体培养基（M17培养基中含 0.5%葡萄糖）；G-SGM17液体培养基：M17干粉培养基37.25 g/L，蔗糖0.5 mol/L，甘氨酸2.5%，115℃高压灭菌20 min，待冷却至50℃以下时加入0.22 μm滤膜过滤的葡萄糖溶液，其终浓度为0.5%。细胞培养相关试剂：DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）细胞培养基（Gibco），胰蛋白酶（0.25%Trypsin，Gibco），PBS缓冲液（双螺旋生物科技，上海），胎牛血清（FBS，Gibco），青霉素和链霉素双抗（Gibco），二甲基亚砜（DMSO，Sigma）

1.1.2 主要试剂及仪器 PrimerSTAR Max聚合酶、DNA Marker 购自宝生物工程（大连）有限公司。限制性内切酶NcoⅠ和SacⅠ、T4DNA 连接酶购自Thermo公司。CCK8检测液购自背景索宝来生物科技有限公司，质粒小提试剂盒以及胶回收试剂盒购自TIANGEN公司。革兰阳性菌质粒小提试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，BCA Protein Assay Kit购自Thermo公司，nisin购自 Sigma公司。非洲绿猴肾细胞株（Vero细胞，实验室保存）。其他试剂均为分析纯。PCR仪Bio-Rad公司，凝胶成像仪Bio-Rad，荧光倒置显微镜（Olypus IX71，日本）。Spectramax M5酶标仪购自美谷分子仪器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据E3和AA6的基因序列，在E3基因序列的 3′端添加Linker（G4S）密码子，在AA6的3′端添加6个His标签，利用Primer 5.0 设计扩增基因的引物：E3-F1：5′- CATG CCATGGCTATGGCGGCCGCTTCCCAG-3′（下划线处为NcoⅠ酶切位点），E3-R1：5′-ATCGAGCTCTTAG TGGTGGTGGTGGTGGTGTGATCCGCCTCCGCCTTGT GGTTTTGGTGTCTTGGGTTCC-3′（下划线处为SacⅠ酶切位点）。AA6-F2 ：5′-ATCGAGCTCATGGCGGCC GCTCAGTTGCA -3′（下划线处为SacⅠ酶切位点），AA6-R2 ：5′-CCCAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTG GTGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTTCTGA-3′（下划线处HindIII酶切位点），引物由生工生物工程（上海）服务有限公司合成。

1.2.2 重组表达载体的构建及蛋白小量表达 PCR分别扩增E3、AA6纳米抗体编码基因，酶切依次将AA6、E3连接至载体pNZ8148 上，双酶切及测序鉴定获得质粒pNZ8148-E3-AA6。按Holo等［10］方法制备乳酸乳球菌 NZ9000感受态细胞。将连接产物通过电穿孔转化法转化到NZ9000感受态细胞中，设置电压2 000 V，电脉冲时间为1.5-5.0 ms。电转细胞在GM17 恢复培养基（含20 mmol/LMgCl2，2 mmol/L CaCl2）30℃培养2 h后，取100 μL涂布到GM17氯霉素抗性平板上，30℃厌氧培养24-48 h。双酶切进行鉴定，重组菌株为NZ9000/ pNZ8148-E3-AA6。

30℃静置培养过夜的重组菌按照1∶100的比例转接至5 mL GM17培养基中（氯霉素终浓度为10 ug/mL），测定不同时间点重组乳酸乳球菌 NZ9000/pNZ8148-E3-AA6的OD600值，在培养至菌液 OD600值为0.4-0.5时加入终浓度为 1 ng/mL 的诱导剂 nisin进行诱导表达，12 h时收集菌体。收集的菌体经超声破碎后，SDS-PAGE和 Western-blot鉴定。

1.2.3 重组乳酸乳球菌的大量表达 将诱导后的菌液500 mL离心，每克湿菌体用3 mL 5 mmol/L咪唑缓冲液重悬，菌体用高压破碎仪进行破碎，4℃12 000 r/min离心30 min 收集上清液。将上清液加入预先用5 mmol/L咪唑缓冲液平衡的Ni-NTA 层析柱内，分别用100（20% buffer B）mmol/L、150（30%buffer B）mmol/L咪唑缓冲液洗脱，并收集洗脱液，SDS-PAGE 电泳检测目的蛋白分离纯化效果，透析至1×PBS溶液，使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。

1.2.4 CCK8法检测二价纳米抗体E3-AA6蛋白对毒素TcdB的抑制实验 在细胞变圆实验中，用不同浓度梯度TcdB处理Vero细胞，并且在显微镜下观察细胞的形态变化。分别统计细胞变圆率，通过观察统计得出，当毒素TcdB浓度为0.0125 ng/mL时，24 h变圆率约为70% 左右，选定此浓度为对照实验施加毒素浓度。将对数生长期Vero细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养基配制1×105/mL细胞悬液，按每孔个细胞约1×104个（100 μL）加入到96 孔细胞培养板中，过夜培养后，进行毒素中和实验。分别设置3个实验组：空白组、对照组、实验组。空白组施加完全培养基，对照组施加完全培养基和0.0125ng/mL TcdB，实验组为Vero细胞同时施加加0.0125 ng/mL TcdB和12.5、25、50 μg/mL的重组纳米抗体蛋白，每个浓度设置3次平行实验。培养2 h，6 h，12 h，18 h和24 h后每孔加入10 μL CCK8 检测液，37℃孵育2 h后，酶标仪在450 nm检测其吸光度值。

1.2.5 统计学处理 采用 Origin 9.1.软件及SPSS 22.0软件进行数据分析，数据以x-±s表示。

2 结果

2.1 重组乳酸乳球菌蛋白表达与鉴定

根据重组乳酸乳球菌的生长曲线确定菌液 OD600为 0.4-0.5时，加入nisin，终浓度为1 ng/ mL。将12h诱导培养的重组乳酸乳球菌，超声破碎处理后进行SDS-PAGE（图1-A）可见经诱导的重组菌在32 kD处有与预期大小一致的条带，未诱导的重组乳酸乳球菌未见相应条带，说明经诱导的目的蛋白在重组乳酸乳球菌中获得表达。

Western-blot、Anti-His-tag抗体检测结果（图2）显示，诱导的重组乳酸乳球菌在32 kD处有特异性条带，表明目的蛋白在重组乳酸乳球菌中获得表达，通过镍柱亲和层析纯化目的蛋白，SDS-PAGE检测（图1-B），BCAProtein Quantification Kit测定其蛋白浓度为 720 μg /mL。

图1 表达产物的 SDS-PAGE分析

2.2 二价纳米抗体E3-AA6蛋白对毒素TcdB的抑制

CCK8法实验结果（图3）表明二价纳米抗体E3-AA6对TcdB有抑制作用，并且TcdB的抑制作用与纳米抗体的浓度呈现一定的正相关，根据公式：抑制率（%）={1-［OD（实验组）-OD（空白）］/［OD（对照组）-OD（空白）］}×100，计算得出当二价纳米抗体E3-AA6浓度为50 μg /mL时，对TcdB的抑制率在24 h时为39%。

图2 表达产物的Western-blotting分析

图3 纳米抗体E3-AA6对毒素TcdB的抑制效应

3 讨论

艰难梭菌广泛存在于自然环境及动物粪便中，是人体肠道中的正常菌群。由于广泛应用广谱抗生素、免疫抑制剂或化疗药物等药物，人体肠道微生物菌群平衡被扰乱，艰难梭菌大量繁殖，引发艰难梭菌感染，导致严重腹泻和肠道炎症甚至死亡。

目前针对艰难梭菌感染，常见的CDI治疗是抗生素治疗［11］，甲硝唑用于CDI轻中度患者，万古霉素用于CDI重度患者，菲达霉素是一种大环内酯类抗菌药物，对艰难梭菌有杀菌活性，但是对其他革兰氏阳性菌作用有限，一般用于治疗复发患者［12］。但近年高毒素菌株出现，药物的敏感性降低，甲硝唑和万古霉素可进一步破坏肠道微生态平衡，艰难梭菌感染复发率很高，且治愈后复发率高达25%-60%［13］。因此抗生素药物需要向窄谱，不可吸收，可重复给药，安全性高等方向发展［14］。另一种新型CDI治疗方式是粪菌移植法，其原理是将健康供体的粪便经过过滤后注入到患者的结肠中，达到重新恢复正常结肠菌群的目的［15-16］。

图4 不同浓度E3-AA6对毒素TcdB 的抑制作用

纳米抗体因其分子量小、高特异性等特性，在治疗艰难梭菌感染方面有着天然优势［17］。本实验室获得了从驼羊血清中分离的抗艰难梭菌毒素的基因E3和AA6，蛋白分子量分别为15 kD左右，通过Linker连接，设计成双特异性纳米抗体，通过乳酸乳球菌表达系统，获得了32 kD的纯化蛋白。在细胞毒素实验中，施加0.0125 ng/mL TcdB，Vero细胞24 h的变圆率为70%，施加50 μg/mL二价纳米抗体E3-AA6，细胞变圆率明显降低，通过CCK8试剂盒测定细胞活性，抑制率达到39%。证明二价纳米抗体E3-AA6对艰难梭菌TcdB有一定的中和作用。结合乳酸乳球菌可通过胃进入到肠道，直接作用于艰难梭菌，为今后的体内实验提供实验依据。

4 结论

本研究成功构建了抗艰难梭菌毒素的重组表达载体pNZ8148- E3-AA6，通过NICE系统实现了二价纳米抗体E3-AA6稳定表达；在对Vero细胞变圆实验及CCK8实验中，E3-AA6能够有效的中和艰难梭菌毒素TcdB。