酮体抑制大鼠海马神经元酸敏感通道的开放

朱飞 徐秦岚 郭安臣 王群

癫痫是一种常见的神经系统慢性疾病，患病率为4‰～7‰，目前全球约有5 000万癫痫患者，我国癫痫患者人数约900万。临床上大约有70%的癫痫患者可以通过药物控制发作，但是仍有约30%的患者为药物难治性癫痫。对于难治性癫痫患者来说，尽管经过长期抗癫痫药物治疗仍然发作频繁，长期癫痫发作会严重影响患者的日常生活和学习、工作能力，损害患者的认知功能，导致患者出现严重的精神、心理障碍[1]。难治性癫痫的控制已经成为一项重要的公共卫生问题，基于新靶点的抗癫痫药物研发有重要的临床意义。

生酮饮食是一种高脂肪、低碳水化合物饮食，其治疗难治性癫痫疗效确切[2-3]，然而作用机制尚不十分明确。长期生酮饮食患者不易耐受，并引发诸多不良反应，例如儿童生长发育延迟、成人动脉粥样硬化风险增加等[3-4]，所以明确生酮饮食的作用机制，并应用于新药研发有重要意义。生酮饮食中多余的脂肪被分解代谢为酮体，包括乙酰乙酸、β羟丁酸和丙酮，目前有研究认为给动物急性注射酮体可以抑制癫痫发作[5-7]，然而具体机制尚不明确。因为酮体是一种酸性物质，而酸敏感通道是一种酸性条件下激活的H+门控通道，据此推测酮体和酸敏感通道之间可能存在一定相关性。所以，本研究针对难治性癫痫的治疗新方法进行研究设想，利用膜片钳技术探讨三种酮体对于海马神经元表面酸敏感通道电流的影响，为基于“酮体—酸敏感通道”的抗癫痫新药靶点提供一定的理论基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取出生24 h内的Wistar乳鼠(由北京维通利华实验动物技术有限公司提供)，原代培养大鼠海马神经元。

1.2 主要试剂及仪器设备

1.2.1 主要试剂 乙酰乙酸锂、β羟丁酸、丙酮、多聚赖氨酸、左旋谷氨酰、胰酶、谷氨酸、葡萄糖(以上试剂购自sigma)，B27补充剂、胎牛血清、DMEM、神经元培养基(以上试剂购自gibco)，青霉素/链霉素(Hyclone)，HEPES(santa cruz)，PBS(TaKaRa)。

1.2.2 主要仪器设备 EPC10膜片钳放大器Heka(Germany)，数据获取软件Heka(Germany)，微电极拉制仪(P97，Sutter Instruments)，分析软件Molecular Device(USA)，二氧化碳细胞培养箱Esco(Singapore)，倒置显微镜Motic(IX71，Olympus)，微操纵器(MP285，Sutter Instruments)，毛细玻璃管(BF150-86-10，Sutter Instruments)，移液器Eppendorf(Germany)。

1.3 实验步骤

1.3.1 原代培养大鼠海马神经元 新生鼠迅速断头，剥离大脑放入冰的PBS中，等待2 min；把脑取出放入一倒有冰PBS的平皿中，将海马取出，放置于10 mL含冰PBS离心管中；将海马放入冰的PBS中洗1～2次；吸干PBS，加入胰蛋白酶，37 ℃培养箱中20 min，每隔5 min摇晃一下；取出酶消化后的组织，吸去酶液，加入冰的PBS终止反应，洗2～3次；静置2 min，去掉上层液体；加入1 mL的DMEM进行吹打，15次后静置2 min，收集上清液，放入离心管中；再加入1 mL DMEM，继续吹打10次，再收集上清液入同一皿中；第3次再加1 mL，重复操作，3次后未消化的组织弃掉；将收集到的上清液放入预先铺好的板中摇匀；4小时后轻摇几下，把死细胞和碎片吸走，再用DMEM清洗1次后换neurobasal+b27+L-Glu培养液；第2 d，半数换液；隔2 d换1次。

1.3.2 膜片钳技术检测酮体对大鼠海马神经元酸敏感通道开放状态的影响用微电极拉制仪将毛细玻璃管拉制成记录电极，电极填充内液，在倒置显微镜下操纵微电极操纵仪，将记录电极接触到细胞上，给予负压抽吸，形成GΩ封接；形成GΩ封接后进行快速电容补偿，然后继续给予负压，吸破细胞膜，形成全细胞记录模式；然后进行慢速电容的补偿并记录膜电容及串联电阻；电压钳模式下-70 mV稳定5 min后-80 mV下进行酸敏感通道记录。所得数据Clampfit进行线下分析。

1.4 统计学处理

2 结 果

乙酰乙酸、β羟丁酸和丙酮均可以显著抑制大鼠海马神经元表面酸敏感通道的开放。在pH6.0条件下分别向细胞外液中加入三种酮体后酸敏感通道的电流波幅均显著降低，抑制率分别为92、47、77%(图1～3，表1～3)。

图1 乙酰乙酸可以显著抑制大鼠海马神经元表面酸敏感通道的开放

3 讨 论

癫痫是神经系统第二大疾病，患病率为4‰～7‰，目前全球约有5 000万癫痫患者，我国癫痫患者人数约900万。癫痫是一种慢性病，给个人、家庭和社会带来严重的负面影响，无论在发达国家还是在发展中国家癫痫都已经成为一个重要的公共卫生问题。目前临床上大约70%的癫痫患者可以通过药物控制发作，但是仍有约30%患者为药物难治性癫痫。对于药物难治性癫痫患者来说，尽管经过长期正规抗癫痫药物治疗仍然发作频繁。长期癫痫发作会严重影响患者的日常生活和学习、工作能力，损害患者的认知功能，并引发患者出现严重的精神、心理障碍[1]，所以对于难治性癫痫的控制显得尤为重要。基于新靶点的抗癫痫药物研发有重要意义，可能带来巨大的社会效益和经济效益。

表1 乙酰乙酸对大鼠海马神经元酸敏感通道电流的抑制作用

注：与对照组比较，*P<0.05

图2 β羟丁酸可以显著抑制大鼠海马神经元表面酸敏感通道的开放

表2 β羟丁酸对大鼠海马神经元酸敏感通道电流的抑制作用

注：与对照组比较，*P<0.05

图3 丙酮可以显著抑制大鼠海马神经元表面酸敏感通道的开放

表3 丙酮对大鼠海马神经元酸敏感通道电流的抑制作用

注：与对照组比较，*P<0.05

难治性癫痫发作频繁，迫切需要新的抗癫痫药物治疗靶点。生酮饮食是一种高脂肪、低碳水化合物饮食，治疗难治性癫痫效果确切，但机制尚不明确。长期生酮饮食患者不易耐受，如能明确其作用机制并应用于新药研发将有重要意义。在生酮饮食中过多的脂肪被分解代谢为酮体(包括乙酰乙酸、β羟丁酸、丙酮)，有研究表明给动物急性注射酮体可以抑制癫痫发作，说明生酮饮食可能通过酮体来发挥作用，但具体机制尚不明确。因为酮体是一种酸性物质，而酸敏感通道是酸性条件下开放的通道，所以本研究设想酮体可能通过调节酸敏感通道来发挥作用。

生酮饮食是一种高脂肪、低碳水化合物饮食，对于难治性癫痫的疗效确切[8]，但具体机制尚不明确。长期生酮饮食患者不易耐受，并引发诸多不良反应，如严重胃肠道反应、儿童厌食症、营养元素缺乏、生长发育迟滞以及成人动脉粥样硬化风险增加等[3-4]。所以，明确生酮饮食的抗癫痫作用机制，应用于新药研发，保留其主要抗癫痫效果，同时避免长期高脂饮食的痛苦，将有重要的临床意义。

在生酮饮食中多余的脂肪酸在肝内进行β-氧化产生乙酰辅酶A，之后被分解代谢为酮体，包括乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮。有研究认为生酮饮食的抗癫痫作用与酮体有关，急性给予酮体在多种动物癫痫模型中均能够有效控制癫痫发作[5-6]，但是具体机制尚不十分明确，有研究认为酮体可能通过作用于K+ATP通道、NMDA或GABA通道来发挥作用[9,10]。

因为酮体是一种酸性物质，而酸敏感通道是一种酸性条件下激活的H+门控通道，所以本研究推测酮体与酸敏感通道可能有一定相关性，因此利用膜片钳技术检测酮体对海马神经元表面酸敏感通道电流的影响，结果发现三种酮体均可以显著抑制海马神经元酸敏感通道的开放，抑制率分别为92、47和77%。据此本研究推测生酮饮食可能是通过其代谢产物酮体抑制酸敏感通道从而发挥抗癫痫作用。

目前已知酸敏感通道(ASICs，Acid-sensing ion channels)，也称作H+门控离子通道，是一类被质子激活的阳离子通道，属于退化素/上皮钠离子通道(degenerin/epithelial Na+ channels,DEG/ENaC)家族，因为H+是ASICs通道激动剂，所以ASICs又可以被看成配体调控的通道家族。ASIC家族成员包括4种基因(Asic1,Asic2,Asic3,Asic4)，到目前为止，已经克隆出ASICs的6个亚单位ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4。组织酸化是激活ASICs的必要条件，ASICs的激活有赖于pH值快速(<1 s)且显著的下降[11-13]。

目前ASICs被视为是酸毒性损伤的重要治疗靶点，并得到了广泛的研究[14-15]。Xiong等[16]的研究显示，脑缺血中脑细胞无氧代谢增强，pH严重下降，导致严重酸中毒而致ASIC1a激活，钙离子大量内流，细胞钙超载后大量死亡。应用特异性ASIC1a受体阻断剂PcTX或非特异性的ASICs受体阻断剂阿米洛利后发现，不论是体内还是体外实验酸中毒所致的神经元损伤都有显著的减轻，脑梗死的范围也大大下降，提示ASIC1a介导了脑缺血过程中酸中毒所致的神经元死亡。因为癫痫发作，尤其是癫痫持续状态也是一种严重的伤害性刺激，所以本研究推测严重癫痫发作后也可能会产生酸敏感通道介导的脑组织酸毒性。又因为酮体可以抑制酸敏感通道开放，所以推测酮体可以通过抑制酸敏感通道介导的脑组织酸毒性，起到一定的神经保护作用。这一假说有待于进一步研究证实。

目前有关酸敏感通道和癫痫关系的研究主要集中在癫痫发作后体内某些酸敏感通道亚单位的表达变化以及某些拮抗剂对癫痫发作的直接作用上。Wu等[17]研究发现给大鼠腹腔注射ASICs拮抗剂阿米洛利能减少大鼠出现RACINE 4级癫痫的比例。癫痫持续状态后ASIC1a/ASIC2a异聚体在梨状皮层急性期表达减少，而在之后的慢性自发性癫痫期增多。Jingjing Liang等[18]给大鼠腹腔注射ASICs拮抗剂阿米洛利后观察大鼠EEG，发现阿米洛利显著减少大鼠匹罗卡品诱发的放电频率，同时发现癫痫持续状态后ASIC1a和ASIC3表达增多。O.Ievglevskyi等[19]利用膜片钳技术观察非选择性ASICs抑制剂5p对海马脑片放电的影响，发现抑制ASICs后自发性抑制性突触后电位放电频率增强，抑制ASICs能够减弱无镁模型和KA模型诱发的癫痫样放电。综上所述，非选择性ASICs受体拮抗剂可以抑制癫痫发作。因为本研究发现酮体可以抑制酸敏感通道，据此推测酮体可以通过抑制酸敏感通道来减弱神经元兴奋性，发挥抗癫痫作用。

综上所述，酸敏感通道某些拮抗剂可以抑制癫痫发作，并且酸敏感通道介导了机体酸毒性作用，而酮体可以抑制酸敏感通道，所以本研究推测酮体可能通过两条途径来发挥抗癫痫作用，一方面可以直接抑制酸敏感通道来减弱神经兴奋性；另一方面可以抑制酸敏感通道介导的酸毒性作用，在癫痫发作过程中起到神经保护作用。“酮体—酸敏感通道”有望成为难治性癫痫药物治疗新靶点，基于“酮体—酸敏感通道”的抗癫痫机制研究有重要的临床意义。