葡萄酒泥中谷胱甘肽提取工艺优化

黄倩，郑晓吉,*，史学伟，单春会，王顺利

（1. 石河子大学食品学院，新疆石河子 832000；2. 新疆唐庭霞露酒庄有限公司，新疆五家渠 831300）

现代葡萄酒的生产过程中，葡萄酒泥中的废酵母是葡萄酒酿造时的主要副产物之一，在酵母发酵后葡萄酒泥通常直接排放至自然环境中，造成很大的生物资源浪费和生态环境污染。葡萄酒泥废酵母中含有大量谷胱甘肽（Glutathione，GSH）[1]，若得以提取可保护环境且具有广阔的商业前景。谷胱甘肽由L-谷氨酸、甘氨酸和L-半胱氨酸三个氨基酸经肽键脱水缩合而成，含有大量的γ-谷氨酰基和巯基生物活性基团。GSH在多种氧化还原反应中作为一种还原剂存在，对部分外源性毒性物质如有机磷、有机氯、农药等具有解毒作用，可用来治疗肝脏等人体解毒性器脏的损伤，延缓中老年人的细胞衰老，增强免疫细胞的分裂和活性，从而增强特异性免疫等。故GSH在医学药学、食品设计开发和保存以及化妆品等领域的需求量不断增加，具有广阔的市场前景和经济效益[2]。

目前国内外关于GSH的制备方法主要有：高压均质法、高压脉冲电场法、研磨法、酶法、超声波法等。高压均质法优点是一次性处理量大、生产效率高、过程简单方便，但破壁后提取的GSH杂质含量太高，产品的纯度过低无法达到工业生产的要求。高压脉冲法能耗低、处理时间短、不会造成遗传物质变性，同时使得浸提液的纯度高，但由于设备昂贵处理量小，不能大规模的应用到工厂生产中。化学方法是利用细胞壁和细胞膜的组成结构使胞内需要提取的成分溶出，但目前由于使用的试剂为不易处理的化学溶剂，对环境影响较大，且提取过程中分解细胞膜和细胞壁，导致提取物不单一，无法达到分离提纯的目的。溶解法是利用某些有机溶剂对酵母细胞壁的成分具有溶解作用，可专一性浸提目的细胞内的物质，且提取效率高，对环境的影响较小。

故本试验采取溶解法提取GSH，提取试剂为乙醇。乙醇能顺利通过酵母细胞的线粒体内膜、外膜以及细胞质膜，且不会像其他化学试剂以破坏细胞壁的三层膜的前提通过细胞的三层膜[3]。通过研究发现，利用热水法和乙醇法提取酿酒酵母中的GSH，乙醇提取法得到的GSH提取量最高。虽然乙醇提取法浸提时间较长，但离心时间得到缩短，杂质含量较低，且GSH的损失也相对较少[4]。这样不仅对GSH进行了纯化，还节约了资源和能源。Xiong等[5]研究发现，体积分数为25%的乙醇能达到对高密度酿酒发酵后的酵母细胞提取GSH的最大值，且最高提取率达到0.31%。李双石等[6]发现，对葡萄酒泥废酵母的最佳处理条件是提取温度50 ℃、时间60 min、添加量10 mL时，能得到最多的GSH提取量。故本试验在设计单因素实验时，对其他变量取上述研究的最优值，对单一变量进行定性研究。为葡萄酒废酵母提取谷胱甘肽的生产提供优化数据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 原料及试剂

葡萄酒废酵母泥，新疆张裕天珠葡萄酒业有限公司；Tris试剂，Amresco公司；5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）试剂，美国Sigma公司。

1.1.2 仪器及设备

80目筛网：安平县筛网丝网有限公司；J-26XP冷冻离心分离机：美国贝克曼库尔特有限公司；SP-756P紫外可见分光光度计：浙江赛德仪器；SHC A-C水浴恒温振荡器：苏州威尔实验用品有限公司；移液器：北京卓信伟业科技有限公司；电子天平：JCS001，天衡仪器制造厂；分析天平：JJ223BC，双杰测试仪器厂；96孔酶标板：丰源器材有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 葡萄酒泥的处理

去离子水与葡萄酒泥混合体积比为1∶1，对混合液进行80目筛网筛分。取筛分液于离心机中，4000 r/min下离心分离20 min，取上清液用去离子水溶解后继续离心分离，重复上述步骤，直至上清液澄清所得的沉淀为白色为止。收集沉淀，将沉淀物置于55 ℃鼓风干燥箱鼓风干燥至能磨粉处理，磨粉后保存于干燥阴暗条件下。

1.2.2 乙醇法提取

称取酒泥废酵母干粉1.00 g于烧杯中，加入10 mL体积分数为25%的乙醇溶液，于恒温水浴锅50 ℃水浴搅拌60 min，离心冷却至室温的浸提液，待浸提液冷却至室温，于3000 r/min离心分离10 min，得到上清液和酵母细胞沉淀，所得上清液即为GSH浸提液。

1.2.3 单因素试验

依据预试验结果，分别固定其他因素水平，考察料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL）、乙醇体积分数（15%、25%、35%、45%、55%）、浸提时间（20、40、60、80、100 min）和浸提温度（30、40、50、60、70 ℃）等因素对谷胱甘肽提取率的影响。

1.2.4 响应面试验设计

根据单因素试验得到的结果，取3个相邻的显著点确定酒泥废酵母谷胱甘肽提取优化设计的试验因素和水平，利用Design-Expert软件对谷胱甘肽提取进行试验方案的设计以及数据结果的分析。

1.2.5 GSH含量的测定

GSH含量的测定采用DTNB法：利用DTNB和GSH反应生成黄色的5-硫代-2-硝基苯甲酸，利用该物质在pH8.0时在412 nm的波长有最大吸收峰，用分光光度计测样液的吸收值，并对所测吸光值做函数图得到标准曲线[7]。

浸提液中GSH含量的测定：用0.5 mL GSH浸提液代替GSH标准溶液，根据上述测定方法来测定乙醇葡萄酒泥谷胱甘肽浸提液的吸光值，利用谷胱甘肽标准品得到的标准曲线线性关系即可计算待测样品中的谷胱甘肽含量。每个处理设3个重复。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

浸提液中GSH的含量用DTNB法来测定，利用Origin Pro软件分析数据得到GSH浓度C与吸光值A的回归方程为A=0.8489C+0.0396（R2=0.0996）。

2.2 单因素结果分析

2.2.1 料液比对酒泥废酵母GSH提取量的影响

由图1可知，随着料液比的比值变大，酒泥废酵母GSH乙醇提取量开始缓慢增加，1∶10 g/mL的料液比时谷胱甘肽的提取量达到峰值，随后提取量开始缓慢降低。因为当乙醇的溶液用量不足或者很少时，酵母细胞细胞壁没有充分的被乙醇溶解破碎，导致细胞的通透性太低使GSH无法从细胞中溶解出；GSH本身不稳定极易氧化，而乙醇的量过多会促进GSH氧化，同时乙醇的添加量变多会导致酵母细胞膜上的γ-谷氨酰转肽酶暴露出来，将GSH降解[8]，使提取出的GSH在提取过程中被氧化，导致GSH提取量减少。由此确定料液比的量初步为1∶10 g/mL。

2.2.2 乙醇的体积分数对酒泥废酵母GSH提取量的影响

乙醇作为有机溶剂能够增强酵母细胞的细胞膜脂类物质的流动性，可以提高细胞通透性，细胞内物质的释放可以大大的加强。由图2得到，乙醇的体积分数大于35%时，GSH的提取量随着乙醇体积分数的增加越来越少，由于GSH是一种易溶于水和低浓度醇，微溶于醇的活性肽[9]，乙醇的体积分数过大时会导致酵母细胞的内外渗透压值很大，致使酵母细胞破裂使大量的其他胞内物质流出，影响谷胱甘肽的纯度，而当乙醇的体积分数过少的时候，很多谷胱甘肽由于乙醇量过少无法提取出来，致使谷胱甘肽的提取量减少。因此乙醇的体积分数初步确定为35%。

2.2.3 浸提的时间对酒泥废酵母GSH提取量的影响

在乙醇体积分数为35%，添加量为10 mL的前提下，设置不同的浸提时间来考察GSH的提取量。由图3得到在20 min的抽提时间时，GSH的提取量较低，浸提时间为60 min时达到峰值，而在当时间达到100 min，GSH的提取量急剧下降。由于细胞内包括GSH在内的多种物质容易于细胞后，胞外溶液浓度提高，胞内溶液浓度降低，细胞内外出现了较大的渗透压差和浓度差，浓度差和渗透压差使得高浓度一侧的物质流向低浓度一侧，导致GSH的提取量很少，35%体积分数的乙醇是稀溶液，为了平衡细胞内外的渗透压，乙醇溶液不断的进入细胞，一段时间后，扩散达到平衡时，浸提的时间就不再起作用。所以在40～80 min时，提取率与时间呈正相关，而在时间超过80 min后，因为GSH的不稳定性导致它的提取量下降，另外一个原因可能是由于GSH是具有强氧化性的物质，具有很强不稳定性，在空气中暴露的时间过长，导致GSH的含量下降[10]。

图1 料液比对GSH提取量的影响Figure 1 Effect of ratio of material to liquid on GSH extraction

图2 乙醇的体积分数对提取量的影响Figure 2 Effect of volume fraction of ethanol on extraction

2.2.4 浸提温度对酒泥废酵母GSH提取量的影响

在乙醇体积分数为35%，添加量为10 mL，浸提时间为60 min的前提下，考察了不同浸提温度对GSH提取量的影响。由图4得到，乙醇提取酒泥废酵母GSH的量随着浸提的温度升高呈现为先升高后降低的趋势，在50 ℃时达到峰值。原因是浸提的温度对GSH的稳定性有很大的影响，GSH的氧化速度与温度成负相关，高温条件下会导致GSH氧化损失从而导致结果值出现误差；但如果浸提的温度过低，会使酵母细胞壁和细胞膜与乙醇的相互作用变弱，GSH不易从细胞膜细胞壁溶出[11]。故乙醇提取酒泥废酵母的GSH浸提温度初步确定为50 ℃。

图3 浸提时间对GSH提取量的影响Figure 3 Effect of extraction time on GSH extraction

图4 浸提温度对GSH提取量的影响Figure 4 Effect of extraction temperature on GSH extraction

2.3 优化工艺条件

2.3.1 响应面试验的模型设计

以上述单因素试验的结果为基础，用谷胱甘肽的最终提取率为考察指标，有目的选择出4个单因素当中提取率较高的3个水平进行考察探究，从而更靠近本试验的目的，更有利于最佳提取率的得出。利用Design-Expert V10.0.4 软件对谷胱甘肽提取进行试验方案的设计和数据结果的分析。得到表1、表2、表3、表4。

表1 响应面因素水平及编码Table 1 Response surface factor level and coding

表2 响应面结果与分析Table 2 Response surface results and analysis

表3 回归方程系数及其显著性检验结果Table 3 Regression equation coefficients and their significance test results

表4 模型验证结果Table 4 Model verification results

运用Design Expert程序对表3的数据进行多元回归拟合，分析响应值比较显著的各项单因素，可得料液比、乙醇体积分数、浸提时间、浸提温度与GSH提取量间的二元多项回归方程：

由表3可以得到，模型回归显著（p＜0.0001），可以看出方程的一次项、二次项的影响都是显著的，模型的校正决定系数R2adj为0.9911，说明99.11%响应值的变化能通过此模型解释，可以确定该模型的设计值与试验值拟合较好，试验误差很小。其中影响因素料液比＞乙醇体积分数＞浸提时间＞浸提温度。通过以上数据得分得到相应的数据，该试验可以用于酒泥废酵母谷胱甘肽的浸提工艺的理论预测。

对得到的回归方程进行方差分析以及显著性检验，结果如表4。从表4可知，模型预测值与实际得到的值吻合的很好，该回归方程可以用来确定最佳提取工艺的条件。

2.3.2 响应面结果图形分析

根据回归方程做出的模型响应曲面及其等高线如图5至图7所示。

对任何双因素交互影响谷胱甘肽提取率的效应可通过图5、图6、图7进行分析。得到了影响程度的强弱排序为：料液比＞乙醇的体积分数＞时间＞温度，这与模型设计得到的方差分析的结果一致，说明了模型的试验结果具有很强的可靠性。通过模型得到的回归方程，利用软件对其进行求解，以GSH的含量为指标，得到谷胱甘肽提取的最佳提取条件为：在料液比1：10.15 g/mL、乙醇体积分数35.51%、时间58.39 min、浸提温度48.90 ℃，能得到最大的谷胱甘肽的提取量为8.8213 mg/g。根据响应面设计得到的最优条件，对葡萄酒泥废酵母浸提，得到谷胱甘肽的提取量为8.8198 mg/g，与理论设计得到的值相比较，实际浸提得到的值与理论值相差很少，说明模型设计优化方案有效。

3 结论

本试验以葡萄酒泥废酵母液为原料，以4个单因素的试验结果为基础，通过响应面分析法确立了乙醇提取酒泥废酵母中GSH的最佳提取工艺参数，并确保了提取谷胱甘肽最优工艺参数的稳妥性和可靠性。在料液比为1∶10.15 g/mL、乙醇的体积分数为35.51%、浸提时间为58.39 min、浸提温度为48.90 ℃的条件下对谷胱甘肽进行浸提，谷胱甘肽的平均提取率可以达到8.8213 mg。此研究提高了谷胱甘肽的提取率，对从葡萄酒酒泥中提取谷胱甘肽提供了实验基础。

图5 时间和温度等高线图及交互项因素响应面图Figure 5 Time and temperature contour map and interaction factor response surface diagram

图6 时间和乙醇体积分数等高线图及交互项因素响应面图Figure 6 Time and ethanol volume fraction contour map and interaction factor response surface diagram

图7 料液比和浓度等高线图及交互项因素响应面图Figure 7 Material to liquid ratio and concentration contour map and interaction factor response surface diagram