混菌发酵对葡萄酒感官品质和风味物质的影响

许维娜，耿常乐，任同同，孔祥君

（1. 滨州医学院药学院葡萄酒学院，山东烟台 264003；2. 烟台张裕集团有限公司/山东省葡萄酒微生物发酵技术重点实验室，山东烟台 264001；3. 烟台迈百瑞国际生物医药有限公司，山东烟台 264006）

葡萄酒发酵过程中，酵母菌的种群组成及变化对葡萄酒的风味和品质有重要影响[1]。采用多种酵母菌混合发酵，不同于单一酵母菌发酵，能使发酵产品表现出更好的特性，如增加酒体的复杂度等[2]。混菌发酵过程中，各种酵母或者代谢产生一些有益的风味化合物如高级醇、酯类等，或者降解某些异味物质如乙酸、乙醛等，或者促进其他酵母的代谢性能，从而最终改变发酵产物的风味特征，使发酵出来的葡萄酒风味更佳丰富、浓郁[3-6]。综合说来，混菌发酵并不是两种微生物的简单混合，在发酵中各菌种会产生明显的互补增效作用，大大提高产品质量。目前，混菌发酵在葡萄酒行业普及程度低，具有极大的开发前景。

目前，葡萄酒混菌发酵的相关研究多采用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）与非酿酒酵母（non-Saccharomyces）混合发酵，如赵宾宾[7]采用酿酒酵母与浅黄隐球酵母（Cryptococcus flavescens）混合发酵，韩姗姗[8]采用酿酒酵母与柠檬形克勒克氏酵母（Kloeckera apiculata）混合发酵，Moreira等[9-10]采用酿酒酵母与葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、季也蒙有孢汉逊酵母（Hanseniaspora guilliermondii）混合发酵。非酿酒酵母虽然发酵风味较好，但发酵产品也存在一些隐患，如食品安全问题等。

本研究选择两株酿酒酵母（速度型发酵菌株和风味型发酵菌株）进行混合发酵，考察不同接种比例对发酵产品感官特性和风味物质的影响，探索最适合的发酵比例，为葡萄酒发酵工艺的优化提供了一种有效的途径。

1 材料与方法

1.1 样品来源

酿酒酵母S2，速度型发酵菌株，本实验室2016年分离自大柳行葡萄基地；酿酒酵母F6，风味型发酵菌株，本实验室2016年分离自大泽山某葡萄基地；酿酒葡萄‘蛇龙珠’取自烟台蓬莱某葡萄园，除梗破碎后取汁。

1.2 主要试剂和设备

蛋白胨、酵母粉，英国OXFID公司；葡萄糖、琼脂、盐酸、氢氧化钠，国药集团化学试剂有限公司；斐林A液、斐林B液，无锡市亚泰联合化工有限公司；3-辛醇、氩气，山东天海有限公司。

Cary 60 UV-Vis紫外分光光度计，安捷伦科技公司；卧式全温振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；TSQ8000Evo气相色谱-质谱联用仪，美国Thermo公司；附温度计密度瓶，上海垒固仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 葡萄酒酵母的活化与浓度测定

将酿酒酵母S2和F6接种到YEPD液体培养基中，于28℃，150 r/min振荡培养24 h。按5%的接种量接种至葡萄汁液体培养基，相同条件下振荡培养24 h，重复1次，得到活化的野生葡萄酒酵母。

活化后的酵母适度稀释后，紫外分光光度法测量其吸光度值（OD600），计算酵母菌浓度，以此为依据计算接种量。计算公式：酵母菌浓度/(个/mL)＝OD600×稀释倍数×107。

1.3.2 接种与发酵

共设7个试验样品，其中S2与F6的接种比例分别为6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6（样品1～7），S2和F6单独接种作为对照（样品8、9）。24～26 ℃进行发酵。

发酵开始后，每天监测比重、温度、CO2、失重量，重量、比重基本不发生变化时结束发酵。发酵液低温澄清后进行倒罐，转入新的发酵罐低温储藏。

1.3.3 葡萄酒的理化指标检测

葡萄酒的总糖与还原糖测定采用斐林滴定法，总酸的测定用酸碱滴定法，酒精度的测定用密度瓶法[11]。

1.3.4 香气成分检测

利用顶空固相微萃取法进行香气富集，气相色谱-质谱法检测香气物质，参考李凯等[12]方法。取5 mL酒样于萃取瓶中，加入转子和1.5 g NaCl、200 μL 3-辛醇，50 ℃水浴预平衡10 min，将活化的萃取头插入样品瓶的顶空部分萃取50 min，将进样器插入进样口10 min进行测样。GC-MS法分析测得的香气物质的峰面积及出现时间，通过对比3-辛醇的面积及浓度计算该香气物质的浓度。色谱柱为CP-WAX57CB，进样量10 μL，色谱条件是载气流速0.8 mL/min，空气流速300 mL/min，分流比30∶1，进样口温度250 ℃。

1.3.5 感官评价

参照GB/T 15038—2006[13]中香气评价方法，由15位品酒员组成感官评价小组，对不同比例的酵母酿造的葡萄酒分别从外观（20分，包括澄清度及挂杯性10分、色泽10分）、香气（40分，包括风味特征20分、协调性20分）、口感（40分，包括口感特性20分、协调性20分）三个方面进行感官评价。

2 结果与分析

2.1 理化指标分析

如表1所示。所有样品的残糖都在4 g/L以下，酒精度在11.04～12.89 %vol，总酸在4.01～4.25 g/L。混菌发酵样品普遍糖含量较低，糖利用程度较高。S2单独发酵的样品酒精度最高，其糖耗主要进行酒精发酵；F6单独发酵的样品酒精度最低；混菌发酵样品的酒精度介于两者之间。

表1 发酵样品理化指标Table 1 Physicochemical indexes of fermented samples

2.2 香气物质检测结果

通过顶空固相微萃取和气相色谱-质谱方法对葡萄酒香气成分进行分析，共检测出56种香气成分，按照结构特性将56种香气物质分为酯类（表2）、醇类（表3）、酸类（表4）、羰基化合物（表5）、萜烯醇类（表6）六大类。从表中可以看出，不同比例接种的酒样所含的香气物质不同，香气物质中以醇类和酯类物质为主，酯类种类最多，醇类和酸类次之，羰基化合物、萜烯醇类在总含量中所占比例很小。

如表2所示，各样品中共鉴定出酯类香气物质24种，其中单菌发酵的酒样中拥有21种，表明混菌发酵过程中，不同菌株互相激发和促进，产生了更多的香气物质。酯类中，辛酸乙酯含量最高，浓度在3.4～4.6 g/L，其他酯类香气癸酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、月桂酸乙酯和十六酸乙酯相对含量也较高，这些酯类在葡萄酒中主要贡献的香气类型是苹果、草莓等果香。酯类物质含量最高的为样品9（风味型菌株F6单独发酵），其次为样品6（S2∶F6=1∶4）。

如表3所示，各样品中共鉴定出醇类香气物质12种，其中除了乙醇含量最多外，3-甲基丁醇、苯乙醇、2-甲基-丙醇和己醇所占比例也较高。醇类物质呈现的除了酒精独特的香味外，还有青草味、玫瑰花香、香料、苦杏仁味等，贡献的主要是植物类香气。醇类物质含量最高的样品为样品8（速度型菌株S2单独发酵），而且速度发酵菌株比例较高的样品中，醇类物质含量也较高。

如表4所示，酸类中含量较高的有辛酸、正癸酸、乙酸和癸烯酸。辛酸是一种低级脂肪酸，它具有干酪味和粗犷味。然而，它在整个酒结构中起着重要的作用，并能抑制芳香酯的水解，因此对于香气平衡具有重要作用。高含量（大于20 mg/L）的C8～C10脂肪酸会表现不良风味，然而低含量可以带来令人愉悦的气味[14-15]。本研究中辛酸的浓度范围为1.32～1.70 mg/L，会对整体香气产生良好的影响。酸中其他物质呈现为不愉悦的香气如腐败味、醋味、黄杨木味等，但含量相对较低，对香气影响较小。

如表5所示，羰基化合物中的大马酮含量相对较高，它具有强烈干果香气，增强了葡萄酒的特征香气[16]。样品9中羰基化合物含量最高。

如表6所示，萜烯醇类物质中的里哪醇和橙花醇、橙花叔醇香气突出，它们主要来源于葡萄果实，在葡萄酒的发酵和储藏过程中很少或不发生改变，是形成品种香气的重要化合物[17-20]。样品6中萜烯醇类物质含量最高。

2.3 感官品评结果

表2 酒样中脂类物质含量 （单位：g/L）Table 2 Contents of esters in wine samples (Unit: g/L)

表3 酒样中醇类物质含量 （单位：g/L）Table 3 Contents of alcohols in wine samples (Unit: g/L)

表4 酒样中酸类物质含量 （单位：g/L）Table 4 Contents of acids in wine samples (Unit: g/L)

表5 酒样中羰基化合物含量 （单位：g/L）Table 5 Contents of carbonyl compounds in wine samples (Unit: g/L)

表6 酒样中萜烯醇类化合物含量 （单位：g/L）Table 6 Contents of terpene alcohols in wine samples (Unit: g/L)

将15名品评员的品评数据进行统计，结果如图1所示。样品6（S2∶F6＝1∶4）得分最高，表现为较明显的果香和发酵香，香气平衡，酒体丰满。相对而言，速度发酵菌株比例较大的样品中，奶酪、肥皂的气味较浓，香气和口感不佳，这主要是因为酵母发酵使二类香气比例变大，掩盖了一类香气，从而降低了葡萄酒的质量。

综合香气物质分析和感官品评结果，认为样品6为最佳样品，即速度发酵酵母与风味发酵酵母接种比例为1：4时酒的质量最好。

3 结论

本研究将速度发酵酵母与风味发酵酵母按照不同的比例接种到‘蛇龙珠’葡萄汁中进行发酵，发酵结束后，对发酵液进行理化指标和香气物质检测，并进行感官品评，探索混合发酵中接种比例对葡萄酒质量的影响。

研究结果表明，单一菌株发酵的葡萄酒有明显的果香但香气较为单一，有些香气物质相较于混菌发酵来说含量较少甚至没有，混合发酵对于葡萄酒香气复杂度的提升有重要意义。速度发酵菌和风味发酵菌的接种比例为1∶4时酿造的葡萄酒风味最好，发酵产品呈现出明显的品种香气和清新的果香和淡花香。相对比例较高的风味型酵母会使葡萄酒在发酵过程中形成的发酵香气更为复杂、浓郁，但如果风味型酵母的比例过高，则会使发酵香气掩盖一类香气，使葡萄酒整体呈现奶酪味、肥皂味等不良气味，因此过于追求发酵类香气并不能使葡萄酒的气味更加丰富，而会导致整体酒香失衡从而使葡萄酒质量变差。

本研究探索了接种不同比例的两种酿酒酵母对葡萄酒质量的影响，后期可以在不同比例的基础上，尝试进行顺序发酵，继续优化混菌发酵工艺，利用混菌发酵酿造更具风味的优质葡萄酒。

图1 感官分析雷达图Figure 1 Radar map of sensory analysis