柴胡疏肝散调节“怒伤肝”大鼠即早基因表达*

★ 杨军平 邱丽瑛 肖亮 杨小军 王莹（江西中医药大学附属医院 南昌 330006）

“怒”是基于中医病因学说七情中的一种。《儒门事亲》载“夫怒伤肝，肝属木，怒则气并于肝，而脾土受邪；木太过，则肝亦自病”，肝主升、主动，在志为怒，故而怒与肝联系紧密。“怒伤肝”需清肝泻火、疏肝理气，方以柴胡疏肝散。从现代关于肝的病理生理学研究来看，肝的生理和病理变化与人体多个组织系统关系密切［1-2］。有研究表明［3-4］：中医理论的肝病证候，因应激信号到达下丘脑、垂体，导致发生神经内分泌系统和免疫系统的功能改变。神经系统对信号的应答过程为：胞外刺激因子→“第一信使”→“第二信使”→“第三信使”→靶基因转录［5］。本课题通过研究受体后传导通路中第三信使c-fos、c-jun的表达，从不同作用通路、不同作用环节对柴胡疏肝散的作用机制进行探讨。根据已有的参考资料，对应激所致愤怒的信号传导途径提出如下假设：c-fos、c-jun是第一、第二信使的靶蛋白，又作为核内第三信使启动第一信使（神经递质、肽类激素）和下游相关基因转录，从而形成一个信息传导环路。作用环节可能是通过下调第一信使和第二信使而发挥作用。本研究将验证上述假设。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性Wistar大鼠50只，体质量（180±10）g，许可证号：（赣）2016A023，购于江西省实验动物中心，所有动物实验前适应环境一周，实验室环境22℃～25℃。实验动物随机分成5组：正常对照组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组，每组10只。柴胡疏肝散加减是我院国家名中医饶旺福教授的协定方，临床疗效显著［6］，柴胡疏肝散加减由柴胡10g，枳壳10g，香附10g，川芎10g，郁金10g，延胡索10g，炙甘草3g等中药组成。常规水煎，分别浓缩成含生药量0.3g/mL、0.6g/mL、1.2g/mL三种剂量，4℃冰箱保存备用。

1.2 试剂和仪器 PTC-100TMPCR仪（MJ Research Inc.公司）；凝胶成像分析系统（Ampharmacia公司）；DL-822色谱工作站（大连化物所色谱中心）；AMV逆转录酶（上海Promega公司）；Tap DNA聚合酶（上海Promega公司）；PCR Mix（上海Promega公司）；370bp DNA ladder（Ivitrogen公司）；兔抗c-fos、兔抗c-jun（上海博耀生物科技有限公司）；免疫组化染色试剂盒、0.01M枸橼酸盐缓冲液、DAB显色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；图像采集分析仪器（3Y-international Co. LTD，U.S.A）。

1.3 动物造模 雄性Wistar大鼠，室温、通风良好，立体定位器AP-1，RL±1（矢状面左侧和右侧各1cm）H6处用直流电压10V，通电30s破坏双侧膈区。术后缝皮，常规消毒，全部动物手术后24～48h出现明显的怒行为反应：直立、对峙、嘶咬、鸣叫，对外界声响和震动反应敏感、肌紧张升高，双目直视对方、扩瞳，有时恐惧、不安，学习、记忆行为减退，这些结果表明“怒伤肝”大鼠模型成功［7］。

1.4 一般情况观察 观察大鼠的精神状态、饮水、摄食、毛发及活动情况等。

1.5 免疫组化法检测大鼠海马及大脑皮层c-fos、c-jun的表达 实验结束后，立即处死，迅速取出大脑于冰面上快速分离出海马、大脑皮层，立即置10%甲醛中固定，进行常规组织脱水、浸蜡、包埋、切片，切片厚约3～4μm。经免疫组化染色后，利用光学显微镜观察、图像分析系统进行图像的采集和处理。在光镜下观察可见，细胞核形状多为圆形或卵圆形，核膜染色略呈黄色颗粒状，位于胞浆内。高倍镜下，随机观察大鼠脑切片无重叠的视野，对阳性细胞计数，应用图像分析系统分析所有切片的每个视野的平均灰度。

1.6 R-T PCR法检测大鼠海马及大脑皮层c-fosmRNA、c-junmRNA的表达 实验结束后，立即处死，迅速取出大脑，在冰面上快速分离出大脑皮层、海马，立即置液氮中，随后于-70℃低温冰箱中冻存待用。引物：c-fos：扩增产物370bp，上游引物：5’-gcc ttt cct act acc att cc-3’下游引物：5’-atc tta ttc ett tcc ctt cg-3’；c-jun：扩增产物328bp，上游引物：5’-tac gct gcc cag tgt cac ct-3’下游引物：5’-cgt ctg cgg ctc ttc ctt ca-3’。先提取总RNA，保证纯度达标，在逆转录酶的作用下以mRNA为模板反应生成cDNA，又以cDNA为模板，进行PCR反应实验，逆转录RT-PCR测定基因表达。取扩增产物于琼脂糖凝胶电泳，进行电泳条带净面积分析，并用凝胶成像系统拍照。标本mRNA的表达水平参数计算：标本mRNA的表达水平参数=标本靶基因条带净面积参数/内参基因的净面积参数

2 结果

2.1 一般情况观察 除正常对照组外，各组大鼠均出现神态倦怠、扎堆懒动、毛色无光泽、对食物的辨别反应减弱、饮水次数减少、伴有大便稀溏等现象，有个别大鼠出现轻微的口鼻出血现象。

2.2 柴胡疏肝散对大鼠脑组织c-fos和c-jun阳性细胞数的影响 模型组的大鼠脑组织（海马、大脑皮层）c-fos、c-jun阳性细胞数明显升高，与正常对照组比较，具有统计学差异（P＜0.05）。治疗后，各给药组大鼠脑组织（海马、大脑皮层）c-fos、c-jun阳性细胞数呈现不同程度的降低，与模型组比较，中药中剂量组降低有显著差异（P＜0.05）。说明柴胡疏肝散能调节大鼠脑组织c-fos和c-jun阳性细胞数量。

表1 柴胡疏肝散对大鼠脑组织c-fos、c-jun阳性细胞数的影响（，n=10）

表1 柴胡疏肝散对大鼠脑组织c-fos、c-jun阳性细胞数的影响（，n=10）

注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 c-fos(海马） c-fos（大脑皮层） c-jun（海马） c-jun（大脑皮层）正常对照组 16.16±3.88 21.30±4.01 14.16±2.82 15.22±3.63模型组 37.75±5.28# 45.61±7.18# 32.68±3.63# 37.46±3.91#中药低剂量组 35.91±4.81 42.41±7.24 30.33±2.78 35.56±3.75中药中剂量组 18.00±4.45* 23.10±3.75* 15.56±3.23* 16.66±2.76*中药高剂量组 34.50±5.13 43.24±6.28 30.11±3.42 35.02±4.19

2.3 柴胡疏肝散对大鼠c-fos和c-jun阳性细胞灰度的影响 模型组的大鼠脑组织（海马、大脑皮层）c-fos、c-jun阳性细胞灰度明显升高，与正常对照组比较，具有统计学差异（P＜0.05）。治疗后，各给药组大鼠脑组织（海马、大脑皮层）c-fos、c-jun阳性细胞灰度呈现不同程度的降低，与模型组比较，中药中剂量组降低有显著差异（P＜0.05）。说明柴胡疏肝散能调节大鼠脑组织c-fos和c-jun阳性细胞灰度。

表2 柴胡疏肝散对大鼠脑组织c-fos、c-jun阳性细胞灰度的影响（，n=10）

表2 柴胡疏肝散对大鼠脑组织c-fos、c-jun阳性细胞灰度的影响（，n=10）

注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

组）正常对照组 162.42±41.74 151.76±34.05 181.55±38.25 172.68±31.78模型组 256.44±71.72# 251.23±67.64# 298.13±69.69# 303.27±67.74#中药低剂量组 236.00±66.28 242.57±68.28 296.37±66.35 298.19±70.02中药中剂量组 172.17±46.02* 161.16±34.53* 192.53±36.55* 181.49±34.78*中药高剂量组 229.24±65.80 238.49±67.21 269.17±68.74 291.26±68.56

2.4 柴胡疏肝散对大鼠c-fos mRNA和c-jun mRNA表达的影响 模型组的大鼠脑组织（海马、大脑皮层）c-fos mRNA和c-jun mRNA的表达明显升高，与正常对照组比较，具有统计学差异（P＜0.05）。治疗后，各给药组大鼠脑组织（海马、大脑皮层）c-fos mRNA和c-jun mRNA表达呈现不同程度的降低，与模型组比较，中药中剂量组降低有显著差异（P＜0.05）。说明柴胡疏肝散能调节大鼠脑组织c-fos mRNA和c-jun mRNA的表达。

表3 柴胡疏肝散对大鼠脑组织c-fos mRNA和c-jun mRNA表达的影响（，n=10）

表3 柴胡疏肝散对大鼠脑组织c-fos mRNA和c-jun mRNA表达的影响（，n=10）

注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 c-fos(海马） c-fos（大脑皮层） c-jun（海马） c-jun（大脑皮层）正常对照组 1.36±0.15 1.04±0.13 1.16±0.14 1.02±0.11模型组 10.28±2.89# 11.03±2.61# 9.94±2.41# 11.13±2.75#中药低剂量组 8.96±2.53 8.49±2.31 8.19±2.79 8.74±2.56中药中剂量组 5.18±1.04** 6.09±1.96** 5.96±1.53** 6.12±1.73**中药高剂量组 9.01±2.04 9.25±2.16 8.32±2.12 8.67±2.05

3 讨论

“怒则阳气逆上，而肝木乘脾，故甚则呕血及飧泄也。”怒为肝志，怒太过，最易伤肝。“怒伤肝”作为情绪应激的一种，它的反应主要与下丘脑、网状结构、边缘系统、大脑皮层等部位有着密切关系，其中边缘系统在情绪发生中起重要作用。本研究主要从“怒伤肝”的脑中枢机制-边缘系统、大脑皮层着手，通过免疫组织化学技术分析柴胡疏肝散对“怒伤肝”大鼠海马及大脑皮层c-fos、c-jun表达的影响，通过R-T PCR法分析柴胡疏肝散对“怒伤肝”大鼠海马及大脑皮层c-fos mRNA、c-jun mRNA表达的影响，同时采用图像分析系统对脑中枢机制部位Fos蛋白、Jun蛋白表达进行了研究，进一步探讨中药调节应激反应与第三信使的机制关系。

本研究结果显示，与空白组相比，模型组大鼠c-fos、c-jun表达的阳性细胞数、阳性细胞灰度值及c-fos mRNA、c-jun mRNA升高，相比差异有显著性（P＜0.05）。说明“怒伤肝”应激可以诱导下脑中枢机制部位c-fos、c-jun的表达，作为神经中枢的下丘脑参与了应激的调控。与模型组相比，中药高、中、低组均能使大鼠c-fos、c-jun表达的阳性细胞数、阳性细胞灰度值及c-fos mRNA、c-jun mRNA呈现不同程度的下降，中药中剂量组下降明显，差异显著（P＜0.05）。推测降低脑中枢机制部位c-fos、c-jun为柴胡疏肝散调节“怒伤肝”应激的可能机制。

c-fos、c-jun的第三信使假说［8-10］：第一信使是“怒伤肝”这种应激把第一级神经元的兴奋引起神经递质（或激素）分泌的过程。第一信使传来的信息作用于靶细胞的细胞膜，由跨膜将信号传入细胞内，激活第二信使，引起靶细胞、效应细胞的特定反应，这些反应激活即早基因（c-fos、c-jun）的转录，同时偶联第一、第二信使传来的信息与靶基因表型的改变，形成第三信使［11］。第三信使调节靶基因的表达，使细胞表型发生改变，通过神经系统的生理反应来调控细胞。柴胡疏肝散调节应激反应系通过脑组织以外的自主神经内分泌系统来实现，均与c-fos、c-jun有关系，提示c-fos、c-jun是“怒伤肝”应激机制中一个不可缺少的环节，“怒伤肝”参与应激有关的神经递质系统，有可能由于受到第二信使的诱导。