甜菜BvMARB基因全长cDNA的克隆和序列分析

鲁振强 ，潘彦遥 ，王锦霞

（1.黑龙江省普通高等学校分子生物学重点实验室/黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨 150500；2.黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨150080）

核基质附着区结合蛋白 （matrix attachment regions binding proteins，MARB），在核基质附着区（matrix attachment regions，MAR）有特异性结合的蛋白质。首先，MAR广泛分布于真核生物细胞核中，由非组蛋白的纤维蛋白和RNA组成，它在DNA的结构、RNA的转录调控、染色体的成分与结构及减数分裂、基因表达调控等[1－3]中发挥重要作用。核基质附着区功能的研究尤为关键，而MAR与染色质结构之间的互作和细胞体的生理代谢路径存在关联，更多的研究证据表明，MAR及其特异性结合蛋白的关系更紧密。通过体外研究发现，某些关联蛋白具有核基质附着区特异结合能力和核基质的骨架组分，那么这些MAR结合蛋白就是MAR与核基质相互作用的实验证明。最新研究表明，来自于多种生物体内MARB的成功分离，植物中的MARB首次从番茄中分离获得，是一种核基质附着区结合丝状蛋白MFP1[4]，一种同工异构型的MARB蛋白AHM1之后在小麦中被分离获得[5]，小麦的AHM1属于多体蛋白，包括有序列同源区、AT功能结合域以及锌指拉链蛋白的结构域，含有AT功能结合域的新型MARB的核蛋白AHL1后续又获得[6]，它对核基质和MAR的结合具特异性的耦合效应。有实验数据显示，核基质附着区结合蛋白不但具备增强调节，同时也发现了其负向调控目的集合区域附近关联的基因，其中包括一些反式作用因子，包括一些调节细胞程序化死亡的表达基因。例如p53、p21、C－myc及Bcl－2家族等。其中，p53与核基质附着区的结合具有特异性、高亲和性，这种结合增加了随后DNA复制的突变[7]。另外，Bcl－2调控了促进细胞程序化凋亡蛋白的表达，Bcl－2的MARs不仅与HL260细胞的MARB结合，还表现了与其功能密切相关性[8]。C－myc家族成员Bax是编码了一种细胞程序化凋亡表达因子，C－myc编码序列的功能区是一段长度为33 bp的短肽，富含AT的核酸保守序列[9]，与MARB发生互作，参与细胞调控[10]。

从上世纪80年代开始，黑龙江大学甜菜科研团队，采用具有优良遗传资源的野生白花甜菜（Beta corolliflora Zoss）与普通栽培甜菜（Beta vulgaris）进行杂交实验，研究中发现了具有无融合生殖特性的单体附加系，最终获得并鉴定命名了甜菜M14品系，在细胞胚胎学和遗传学特征上具有鲜明的无融合生殖现象，是克隆无融合生殖基因极为难得的材料[11－12]。以往对植物生殖发育的研究主要以拟南芥、烟草等模式植物为材料，本次以甜菜M14品系为试材克隆了MARB基因的全长cDNA序列，这不仅有助于甜菜优良品种的选育研究，而且对于进一步阐明植物生殖发育的分子调控机理也具有重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

实验地在黑龙江大学，植物材料以甜菜（Beta vulgaris）单体附加系M14品系为试材。

主要试剂：TRIzol（InvitroGen）；cDNA反转录、PCR、RACE、T载体、胶回收等试剂盒购于大连宝生物（Takara）；所用引物由上海生物工程公司合成；其他相关生化试剂纯度级别为进口分析纯。

1.2 总RNA提取及反转录PCR

取1 g甜菜盛花期的花蕾，迅速置于液氮中，并置于－70℃冰箱保存备用。TRIzol法提取甜菜的总RNA。根据其他物种的MARB基因核苷酸序列进行比对，找出其高度同源的序列。设计简并引物BvMARB－1和BvMARB－2（表 1）。取花蕾总 RNA 1 μg，进行反转录。以反转录产物为模板，以 BvMARB－1 和 BvMARB－2 为引物，利用LA Taq进行PCR扩增。程序为：94℃预变性3 min，94℃变性50 s，55℃退火50 s，72℃延伸2 min，32个循环，72℃延伸12 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

1.3RACE

1.3.1 3′RACE 根据已克隆的MARB基因的保守片段和真核生物3′末端具有Poly尾的特性，利用PrimerPrimier 5.0设计3′RACE引物：BvMARB－3，M13 Primer M4（表1）。PCR反应体系为：反转录产物10 μL，25mmol/L MgCl23 μL，10×LA PCR Buffer II 4 μL，TaqTM 0.25 μL，M13 Primer M4 0.5 μL，BvMARB－3 Primer 0.5 μL。退火温度为60℃，31个循环。1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.2 5′RACE 根据已克隆的 3′RACE序列， 在其 5′末端设计两组引物：BvMARB－GSP1、BvMARB－GSP2（表 1）。取 3 μg RNA 进行反转录，以 5′CDS 引物、SMART II A 为引物。70℃保温 2 min，冰上冷却 2 min，随后加入 5×First－Strand buffer 2 μL，DTT 1 μL，10 mmol/L dNTPs 1μL，Reverse Transcriptase 1 μL，42℃反应 1.5 h。 加入 TE（Tricine－EDTA）缓冲液 100 μL，72℃保温 7 h。

以上述反转录产物为模板，以10×UPM、GSP为引物，进行降落PCR，程序为：94℃ 30 s，72℃ 3 min，5个循环；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，5 个循环；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 30 s，25 个循环。 产物于 1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 序列测序拼接及RT-PCR验证和酶切验证

将反转录PCR的产物、3′RACE的产物及5′RACE第二轮的产物分别连接到T载体上进行测序。利用DNAMAN软件将3′端和5′端的保守区段进行重叠序列拼接，并根据此序列设计引物 （BvMARB－4、BvMARB－5，表1）扩增全长的cDNA序列。对PCR验证后的阳性克隆用SacI进行酶切鉴定。

表1 BvMARB扩增引物Table 1 PCR primers of BvMARB gene

2 结果与分析

2.1 甜菜BvMARB全长cDNA序列扩增

通过对甜菜花蕾的总RNA反转录的PCR扩增，获得了582 bp的特异条带（图1）。通过序列同源比较发现，其与烟草（GenBank No.AB059832）、番茄（GenBank No.BT013761）和拟南芥（GenBank No.AY096684）的相应保守片段相似率分别为84.02%、81.96%和81.27%，初步证实了获得的特异条带为目的基因BvMARB的基因片段。

为了获得全长cDNA序列，实验继续采用了3′RACE和5′RACE扩增。如图2a所示，通过3′RACE PCR，获得了1.6 kb大小的产物片段；同时，5′RACE扩增的结果显示，第一轮扩增并没有获得明显条带；继而取第一轮5′RACE产物稀释10倍后作巢式PCR的模板，扩增BvMARB基因的5′末端，电泳结果出现大约667 bp 的条带（图 2b）。

图1 甜菜BvMARB基因核心片段的PCR扩增Fig.1 PCR of sugar beet BvMARB's core sequence

图2 甜菜BvMARB基因3′RACE和5′RACE扩增Fig.2 3′RACE and 5′RACE of sugar beet BvMARB

图3 甜菜BvMARB全长序列鉴定Fig.3 Identification of BvMARB's full length sequence

2.2 甜菜BvMARB基因的克隆

将已测序的BvMARB cDNA保守片段3′末端和5′末端片段相互重叠，从而拼接出全长cDNA序列。为了进一步确定所获得基因的正确性，实验分别对甜菜BvMARB全长基因进行了PCR和酶切检测。PCR扩增后在1 800 bp左右的位置获得了目的条带（图3a）；而由于BvMARB全序列上有两个SacI单酶切位点，因而经酶切鉴定后应得到一个1 000 bp和两个400 bp左右的片段（图3b）。

2.3 甜菜BvMARB全长cDNA序列分析

甜菜BvMARB基因全长序列为2 023 bp，含有690个腺嘌呤（34.1%）、313个胞嘧啶（15.5%）、499个鸟嘌呤（24.7%）和 521 个胸腺嘧啶（25.8%）。采用 NCBI的 Blast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）对核酸序列进行分析发现，BvMARB基因与烟草MARB（GenBank No.AB059832）的相似度为67.20%，与番茄MARB（GenBank No.BT013761）的相似度为61.26%，与拟南芥MARB（GenBank No.AY096684）的相似度为57.19%。 运用 NCBI中的 ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）和 EXPASY（http://au.expasy.org/tools/）对该基因的核苷酸序列进行ORF查找及氨基酸序列推导分析，发现甜菜BvMARB基因中含有一个长度为1 719 bp，编码572个氨基酸残基的完整的开放阅读框，始于50 bp，止于1 768 bp，含有49 bp的5′非编码序列，227 bp的3′非编码序列以及31 bp的poly (A)Tail。该蛋白预期的分子量为63.17 kDa，pI=9.2。通过PSORT（prediction of protein localization sites，version 6.4）分析表明，基因所编码的蛋白主要存在于细胞核中。

3 讨论

甜菜是我国重要的糖料作物，甜菜的M14单体附加系是具有无融合生殖特点的材料，是黑龙江大学具有自主知识产权的研究成果。近年来，重要目的基因的克隆已成为农作物分子育种领域研究的热点。众多研究结果表明植物的生殖是由多基因控制的，属于数量性状遗传特性，同时单基因的表达丰度较低，这就给利用差异显示等方法进行基因克隆带来了难度。甜菜BvMARB是一类具有代表性的生殖相关蛋白。本研究中利用在其它物种中已有的生殖相关基因的保守序列，设计简并引物，结合采用3′RACE、5′RACE技术对BvMARB的全长cDNA序列进行了克隆。研究中通过对扩增条件的反复实验，在扩增5′非翻译领域的序列时，优化了巢式PCR的实验参数，内侧引物和外侧引物进行了交叉使用，采用多轮次的PCR扩增，内侧引物扩增后又使用了外侧引物的扩增片段，降低了产物的非特异性，反应的敏感性得到了大幅度提升。

改良后的RACE扩增体系对未知基因3′端5′端非翻译领域片段的扩增效率大幅提高，出现非特异条带几率也大幅下降。不同物种间的遗传背景差距，使得某一基因在不同物种中的同源性差异很大。另外，基因的表达也存在时空差异性，在某一物种中强烈表达的基因在其他物种中突变为沉默。基因表达的丰度也存在很大差异，在整个开花期和花蕾中具体表达部位也具有不确定性，这便加大了克隆的难度。基因组内的结构看家基因表达丰富，使得克隆出的片段经测序后为一些结构基因的非特异片段，而非目的基因片段，如rRNA基因，表达量基因的克隆比较困难。通过本实验中优化的相关参数，提高了cDNA模板的质量以及用量，优化PCR扩增体系中的多个技术参数，最后获得了BvMARB的全长cDNA序列并进行了初步分析，为后续BvMARB基因的功能研究以及基因的应用奠定了坚实基础。