调节性B细胞分型及其在相关疾病中的作用

黄 艾，邢世杰，聂 君，瞿 越，王建军，江 科

B淋巴细胞通过抗原呈递作用诱导免疫应答，同时产生和分泌相应抗体，在自身免疫性、变态反应性和移植物排斥反应等疾病中发挥关键作用，同时B淋巴细胞对免疫反应也有调节作用[1]。20世纪70年代首先发现了B淋巴细胞的调节作用，此后Katz等[2]在豚鼠延迟超敏反应模型中证实了调节性B(B cells of regulation，Breg)细胞的存在。Wolf 等[3]在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)模型中第一次准确描述了B淋巴细胞的调节功能，之后其他自身免疫性疾病模型如类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)、糖尿病、变态反应性疾病及传染病和肿瘤等相关研究也进一步验证了实验性自身免疫性脑脊髓炎[4-6]。

1 Breg细胞的作用

研究证实，Breg细胞对自身免疫反应发挥抑制作用的主要机制是分泌白细胞介素(interleukin，IL)-10，IL-10是有效的抗炎细胞因子之一，在Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)激动剂、CD40L或IL-21等刺激下，Breg可表达IL-10。在慢性肠道炎症模型中，肠道相关淋巴组织中分泌大量的IL-10并过表达CD1d分子的B淋巴细胞亚群[7]。此外，多发性硬化(multiple sclerosis，MS)小鼠在病情缓解后发现其脾脏中产生分泌IL-10的B淋巴细胞，过继输注分泌IL-10的B淋巴细胞可以减轻疾病的严重程度，而IL-10缺失的小鼠B淋巴细胞则无此作用[8]。还有研究表明，产生IL-10的B淋巴细胞能对小鼠自身免疫疾病发挥调节作用，包括RA、糖尿病等[5]。最近一些研究表明，B淋巴细胞除了以分泌IL-10的方式对自身免疫反应发挥抑制作用外还存在其他抑制免疫的机制，寻找B淋巴细胞介导免疫调节的其他机制具有重要的临床意义，特别是由B淋巴细胞分泌的其他抑制性细胞因子。文献报道Breg细胞可以产生IL-35，而重组的IL-35融合蛋白可以诱导Breg细胞，并促进IL-10以及IL-35的分泌[5]。B淋巴细胞来源的IL-35也作用于T淋巴细胞，诱导Foxp3+Treg细胞群，IL-35诱导产生的IL-35 Treg细胞具有抑制炎症的作用，又称诱导型CD4+调节型T细胞(induced CD4+regulatory T cells，iTR35)[7]。虽然重组的IL-35抑制B220hiB淋巴细胞的增殖，但可选择性诱导体内CD19+CD5+B220lowBreg细胞的扩增[9]。B淋巴细胞中IL-35亚基(p35或EBi3)表达缺乏的嵌合小鼠可进展为严重的EAE，并且对抗沙门氏菌诱导的败血症具有更好的保护作用，在沙门氏菌感染模型中，缺乏IL-35表达的B淋巴细胞可导致Th1细胞数量和脾脏巨噬细胞数量的增加[10]。另一项独立研究表明，IL-35刺激后B淋巴细胞产生IL-35能够抑制过继转移的实验性葡萄膜炎[9]，此外Breg细胞维持自然杀伤细胞(natural killer cells，NKCs)在体内的平衡方面起到至关重要的作用[11]。

2 Breg细胞的分型

最近一系列研究在人类和小鼠中发现了几种不同亚型的Breg细胞，但是目前的研究很难定义特定Breg的表型。尽管迄今为止还没有关于Breg细胞表面活化和谱系的统一标志物特征，然而它们中的大部分都具有表达抗炎细胞因子IL-10的能力。

2.1 小鼠Breg分型

小鼠B细胞发挥免疫调节作用的证据首先是在B细胞缺陷小鼠不能从EAE恢复[12]，随后证明分泌IL-10的B细胞有抑制功能。由于Breg细胞在介导抑制中的关键作用，IL-10主要用作Breg鉴定的标志物。迄今为止，已经在各种小鼠模型中鉴定了一些具有重叠表型和功能的Breg亚型(表1)。(1)B10细胞 虽然边缘区(marginal zone，MZ)B细胞在脾脏中高表达CD1d，但在人和小鼠中CD1d的高表达是不同Breg亚群之间的共同特征。CD1d和CD5的共表达被用于表征脾脏产生IL-10的B细胞群体，即为B10细胞[13]。同时由于主要组织相容性Ⅱ复合体( major histocompatibility complex class Ⅱ，MHC-Ⅱ)缺陷型小鼠缺乏功能性B10细胞，故B10细胞还需要MHC-Ⅱ的表达。在体外通过脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、佛波脂(phorbal 12-myristate 13-acetate，PMA)、离子霉素和莫能菌素的刺激，CD1dhiCD5+B10细胞能抑制多种免疫紊乱相关的炎症反应。B10细胞的抑制作用已在EAE、关节炎、红斑狼疮和慢性肠道炎症等实验模型中得到证实。(2)过渡性2边缘区前体细胞 Evans等[14]首次提出CD19+CD21hiCD23hiCD24hiIgMhiIgDhiCD1dhi表型的脾脏过渡性2-边缘区前体(T2-MZP)B细胞的免疫抑制功能。

表1 人类及小鼠不同Breg细胞亚型、表型和介导因子Table 1 Subtype, phenotype, and mediate factor of human and mouse Breg

引自Mauri C, Menon M;The expanding family of regulatory B cells[J].Int Immunol, 2015,27:479-486

在关节炎小鼠的脾脏中发现T2-MZP B细胞是胶原刺激后分泌IL-10的主要细胞，并且是在体内和体外唯一显示出有抑制能力的亚型[15]。分泌IL-10的T2-MZP B细胞的抑制功能已经在自身免疫性疾病、变态反应疾病及癌症被证实。(3)CD138+B细胞 晚期阶段的B细胞也能产生IL-10，并具有抑制能力。在EAE小鼠的引流淋巴结中发现，分泌IL-10的CD138+浆细胞通过抑制树突状细胞的功能而阻止致病性T细胞的生成，对于抑制自身免疫性炎症至关重要[10]。不同于淋巴结中的CD138+浆细胞，脾脏CD138+B细胞可以通过提供细胞因子IL-10和IL-35而抑制EAE炎症及对沙门氏菌感染的免疫应答。(4)T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域1(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein 1，TIM-1)+B细胞TIM-1是与免疫应答调节相关的跨膜糖蛋白。小鼠主要的Breg亚群包含T2-MZP B细胞、B10细胞、CD138+B细胞和IgA+浆细胞，其中大多数产生IL-10 的B淋巴细胞都表达TIM-1。将TIM-1+B细胞输注给TIM-1-/-小鼠可促进EAE的恢复和移植物的长期存活[16]。(5)B-1a细胞 B-1细胞是天然免疫细胞，其产生大多数天然抗体，特别是IgM，以加快凋亡细胞的清除[17]。天然IgM作为防治病原体的第一道防线，基于CD5的表达，B-1细胞可以进一步分类为功能不同的亚类。CD5+B-1细胞在先天活化后成为IL-10的主要生产者，称为B-1a细胞。进一步的研究表明，表达Fas配体(FasL)的B-1a细胞称为杀伤B细胞[18]。因此，由于它们能够中和入侵的病原体和抑制炎症反应，故天然的B-1a Breg细胞在免疫调节中发挥重要作用。

2.2 人类Breg分型

与小鼠类似，人类Breg细胞有产生IL-10的能力[19]，其分型与小鼠Breg分型存在一部分相同之处，但也存在不少差异(表1)。(1) B10细胞： B10细胞是在外周血中产生IL-10的Breg群，多数B10细胞在CD19+CD24hiCD27+B细胞亚群内，通过产生IL-10而抑制单核细胞产生的TNF-α。与CD40激活的CD24hiCD38hiBreg不同，人B10细胞对LPS和CpG的刺激发生反应[19]。(2) CD24hiCD38hiBreg细胞：在健康个体的外周血CD19+CD24hiCD38hi未成熟B细胞群中发现了此类Breg细胞。体外研究发现，在CD40的参与下，CD19+CD24hiCD38hiB细胞在外周血的B细胞亚群中产生的IL-10量最高，是唯一抑制Th1分化的亚型。除了具有抑制Th1反应和促Th17分化外，CD19+CD24hiCD38hiBregs还可将CD4+T细胞转化为Treg和Tr1细胞[20]。Bregs对Th1的抑制部分地呈IL-10依赖性，需要CD80-CD86与T细胞的相互作用。(3)其他Breg亚型：与Bregs相关的新表型和功能越来越多。与IL-10生产无关并与CD4+CXCR5+程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1，PD-1) +T滤泡辅助细胞(T follicular helper，Tfh)相互作用的PD-L1hiB细胞可以限制记忆B细胞的发育和浆细胞的分化。通过Tfh扩增减少和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)特异性IgG的产生，过继输注PD-L1hiB细胞到MOG诱导的小鼠能改善EAE[21]。

3 Breg细胞在各种疾病中的作用

3.1 Breg细胞与风湿免疫性疾病

过去十年进行了大量关于Breg细胞介导的免疫抑制功能机制的研究，目前的大多数研究都是关于Breg细胞在自身免疫性疾病的作用，已经证明Breg 细胞与T淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和NKCs相互作用而发挥调节功能。近年来，关于Breg细胞在风湿免疫性疾病中的研究逐渐增多。风湿性免疫疾病是自身免疫性疾病，常累及关节和肌肉，发病过程中产生大量的自身抗体，Breg细胞在其中起着重要的免疫抑制作用， B10细胞通过作用于Treg细胞、NKCs等发挥免疫负性调节作用，有研究证实Breg细胞缺失将导致此类自身免疫疾病的发生以及恶化。

RA的病变特征是关节囊和滑膜的慢性炎症，从而导致滑膜增生、软骨损伤和骨侵蚀，最终导致关节破坏，常与系统性多器官血管炎、肺纤维化等有关。小鼠RA模型的研究表明，胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)诱导成熟前B细胞的消耗，从而减轻疾病的严重程度，而疾病发生后B细胞的消耗并不影响疾病严重程度[22]。在人体中，由于使用利妥昔单抗对于B细胞消耗进行治疗的有效性已被证明，因此认为B细胞参与RA的发病，其他研究也证明了Breg细胞的保护功能和治疗潜力。Breg通过过继输注的方式进入嵌合小鼠体内，重新将Treg群调节到正常水平，同时通过抑制Th1和Th17的分化而缓解炎症反应，从而降低γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)和白细胞介素(interleukin，IL)-17细胞因子水平，并恢复Th1/Th2应答平衡。胶原和抗CD40单克隆抗体刺激RA小鼠的B细胞可产生高水平的IL-10和低水平的IFN-γ[23]，将这些B细胞过继转移到免疫的受体小鼠中，通过抑制Th1细胞的分化而抑制CIA的诱导并改善了疾病程度。由于过继转移富含Breg细胞的T2-MZP B细胞给IL-10缺陷的小鼠不能阻止RA的进展，因此B细胞的这种调节作用取决于IL-10的产生。此外，T2-MZP B细胞在抗原诱导的RA模型中对控制自身免疫和炎症起关键作用。T2-MZP B细胞具有抑制Th1和Th17细胞的分化从而促进Treg细胞分化的能力，并且这些细胞过继转移到该抗原诱导的RA模型中可抑制炎症过程。除了T2-MZP B细胞外，离体扩增的CD1dhiCD5+Breg细胞也可通过抑制Th17细胞的分化来延缓CIA的发作并改善疾病严重程度[24]。一项研究对RA患者与正常对照者的外周血中Breg细胞的功能和比例进行比较，正常对照组中 CD24hiCD38hiBreg细胞抑制CD4+CD25-T细胞分化为Th1和Th17细胞，促进其转化成Treg细胞，其中部分通过产生IL-10而发挥作用。相比之下，RA患者的CD24hiCD38hiBreg细胞不能抑制Th17的分化和将原始T细胞转化为功能性Treg细胞。与正常对照组比较，RA组患者外周血CD24hiCD38hiBreg细胞的数量明显降低。RA患者CD24hiCD38hiBreg细胞的量与疾病活动呈负相关[20]。上述研究表明，Breg细胞在缓解RA中发挥重要的作用。

3.2 Breg细胞与变态反应性疾病

变态反应性疾病是一类疾病，临床表现具有异质性。这些病症通常由机体对致敏原的过度炎症反应而引起，并且可导致哮喘、变应性鼻炎和特应性皮炎等。促进变应性炎症的特征性机制在于Th2极化的免疫应答，其中一个重要原因是免疫调节过程的改变导致变应性炎症的发展。最近的研究报道了CD19缺乏增加和延长了接触性超敏反应过程，并发现了B细胞在变应性皮肤疾病中的调节功能[25]。此外，将接触性超敏反应小鼠的脾脏CD1dhiCD5+B细胞过继转移至受体小鼠可以抑制接触性超敏反应[26]。除接触性超敏反应模型外， CpG注射后通过增加滤泡表型的分泌IL-10 的B细胞比例可减少晚期变应性结膜炎模型中的炎症反应。将CpG处理的小鼠脾细胞过继转移至受体小鼠可抑制变应原诱导的炎症反应[27]。其他研究表明，从蠕虫感染的小鼠中分离的B细胞通过分泌IL-10控制致死性变态反应或卵白蛋白诱导的气道炎症[28]，在人体中也证实蠕虫感染可刺激B细胞分泌IL-10[29]。在各种人类变态反应性疾病中，食物过敏是研究最多的一种。人类样品与Breg细胞结合发现，体外用酪氨酸进行特异性再刺激可导致乳汁过敏组中产生IL-10的CD5+B细胞减少，但在耐乳组中不变或增加[30]，这些报告表明Breg细胞在建立对致敏原耐受性方面发挥作用。此外，在蜂毒过敏患者中，自发发展为致敏原的耐受者和进行免疫治疗的患者在CpG培养72 h后较免疫治疗前的患者的抗原特异性Bred细胞水平均升高[31]。此研究还提示Breg细胞在建立致敏原耐受中的重要性。最近一项关于哮喘患者Breg细胞的研究发现，与健康对照组相比，用粉尘螨变应原激活的CD4+T细胞与LPS刺激的B细胞共培养后用于哮喘患者产生的IL-10较少，表明哮喘患者Breg细胞功能缺陷[32]。另一组研究也显示，变应性鼻炎患者中CD24hiCD27+B细胞明显减少[33]。总之，Breg细胞可能有助于抑制变态反应性疾病和建立变应原耐受性，但功能可能受损。用IL-10转染的原代人B细胞分泌较少的IgE，其在变态反应中起重要作用。因此，Breg细胞可成为变态反应性疾病的治疗策略，安全性较好。

3.3 Breg细胞在器官移植中的作用

关于器官移植排斥和耐受的研究进展主要来自动物模型。在小鼠胰岛和心脏MHC错配的同种异体器官移植模型中，移植前异基因供体B淋巴细胞与CD40配体可阻断诱导同种异体移植物存活时间的延长。在肾移植大鼠应用供体B细胞可诱导肾移植的长期耐受[34]。采用CD45免疫抑制靶向治疗来调节T细胞的发育和激活可导致(μMT)B细胞缺陷小鼠耐受性的丧失，过继转移B细胞其耐受性可恢复，表明器官移植的耐受作用需要宿主B细胞[35]。Ding等[36]研究证实，TIM-1是分泌IL-10+Breg细胞的表面标志物，通过抗TIM-1抗体增强该群对Breg的分泌可延长胰岛和心脏同种异体移植物的存活时间，移植前CD4+CD25+Treg细胞的消耗导致同种异体移植物排斥，表明耐受的诱导依赖于Breg和Treg细胞之间的相互作用。临床研究发现，尽管CD19+CD24high CD38high未成熟B细胞参与对自身免疫性疾病的预防，但其在临床肾移植中也发挥着重要作用[37]。关于这种现象直接作用的证据仍然缺乏，但这些研究表明这些细胞可作为耐受性相关性的生物标志物。最近的一项关于这些细胞与临床事件之间关系的纵向前瞻性研究表明，过渡性B细胞数量能保护受体免受急性排斥反应[38]。另一项研究表明，在慢性抗体介导的排斥反应中，活化与记忆B细胞的比例降低，免疫抑制活性受损。此外已有研究表明，CD24high CD27+IL-10+ B细胞对人类慢性移植物抗宿主病的过程具有调控作用[38]。目前，利用B细胞的消耗现象可防止免疫排斥反应的发生，在诱导阶段的耗尽策略可能有助于改变免疫B细胞谱和未成熟Breg细胞的再次出现，但在疾病后期或治疗抗体介导的排斥反应阶段对Breg细胞群可能有害。另一方面要考虑的是B细胞调控在感染发展中的潜在不良反应。B细胞消耗和Breg细胞的损害可能导致感染和某些病毒的再活化[39]。 研究发现肾移植患者中IL-10/TNF-α比值较低，提示移植物的功能障碍。最近的一项前瞻性研究发现，肾移植患者CD19+CD24hiCD38hiB细胞数与移植物排斥率的降低有关，证实Breg细胞在移植耐受中发挥重要作用[40]，这些研究支持Breg细胞作为生物标志物，并在移植物耐受中发挥关键作用。

3.4 Breg细胞与肿瘤

肿瘤的发生主要是免疫系统和癌症干细胞之间的斗争的结果。肿瘤的发生和进展取决于微环境变化，其中白细胞起关键作用。抗瘤性和致瘤性的免疫机制发生于癌症发展的早期阶段，其最终的净效应决定肿瘤是否发展。Breg细胞和Treg细胞等免疫抑制细胞的作用是促进免疫耐受，最终导致肿瘤细胞逃逸。抗肿瘤CD8+T细胞和NKC的浸润以及Breg、Treg细胞和骨髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)水平的降低都导致肿瘤的抑制，反之则支持肿瘤生长。在肿瘤引流淋巴结中，增加B和T淋巴细胞的积累促进淋巴管的生成，并加速肿瘤的转移率[41]。此外，与未发生淋巴管增生且肿瘤生长很小的癌前B细胞缺陷型μMT小鼠相反，癌前Eμ-c-myc小鼠淋巴结中的B细胞积累量与淋巴结的扩增和肿瘤的生长呈正相关。然而，在过继输注初始T2-MZP细胞后，B细胞缺陷型μMT小鼠的肿瘤生长加速，明显证实了转移性和抑制性B淋巴细胞在癌症逃逸中的作用[42]。最近文献表明，B淋巴细胞在肿瘤部位浸润和积累，并在引流淋巴结中建立免疫抑制的微环境，导致对抗肿瘤免疫应答和关键的淋巴网络扩张的抑制，从而促进肿瘤的生长和转移。最近在携带4T1癌细胞的Balb/c小鼠中发现了肿瘤诱发Breg细胞的独特B细胞亚群(tBreg细胞)，验证了Breg细胞在癌症中的特殊作用[43]，显示癌症根除性B细胞被肿瘤微环境中长存的癌细胞“劫持”并转化为免疫抑制性Breg细胞。这些tBreg细胞不符合任何已知的Breg细胞表型，但类似于活化的成熟B2细胞。用高表达CD40、CD80、CD86、MHC I类和II类的tBreg细胞、非调节性CD4+T细胞和转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)进行培养能够使产生CD4+CD25+FOXP3+Treg的细胞显著增加，这反过来又抑制CD8+T细胞的增生，从而促进乳腺癌的逃逸和转移[44]。

研究表明，人类Breg细胞产生过多可导致肿瘤的侵袭性增强和患者的预后差。例如，与健康对照者相比，肝细胞癌患者明显外周Breg细胞明显增加[45]，非小细胞肺癌与IL-10+Breg细胞、CD4+CD25+/highCD127low/-Treg细胞的增加有关。此外，体外研究证实，肺癌细胞与淋巴细胞共培养上调Treg细胞和Breg细胞表型。与未受肿瘤侵犯的相邻组织相比，舌鳞状细胞癌、胃癌和结肠直肠癌患者肿瘤本身Breg细胞增加，与Treg细胞的增加量呈正相关[46]。在黑素瘤和肾细胞癌治疗过程中采用利妥昔单抗来消耗B细胞似乎无明显的治疗作用，同时抗CD20抗体是否有效耗尽Breg细胞仍然未知。但是，选择性地消耗B细胞(包括抗CD20抗体，如利妥昔单抗、拓扑霉素、obinatuzumab等)或Bruton酪氨酸激酶(Bruton tyrosinek inase，Btk)、Lyn、PI3K-δ和Syk抑制剂以及针对其他靶标(如CD22和CD19)的较新抗体都可能逆转B细胞的浸润作用，并减弱B细胞对抗肿瘤免疫反应的作用。选择性B细胞消耗是否可以与提高抗肿瘤免疫力的其他手段有效结合可能是进一步研究的目标。

4 展望与不足

综上所述，在过去10年中， Breg细胞在抑制病理性免疫反应中的作用已被广泛认可。Breg细胞在免疫系统起负调节作用，可以防止潜在的破坏性自身免疫反应和保护性免疫应答。然而，Breg细胞缺乏可能导致自身免疫反应和其他炎症性疾病，而太多的Breg细胞可能引起免疫抑制。因此，Breg细胞的数量是调节免疫系统功能的关键因素。小鼠和人类的多项研究证明，Breg细胞主要通过提供IL-10而抑制炎症反应。因此，IL-10不仅仅是识别Breg细胞的标志物，而且也是Breg细胞免疫抑制的重要介质。随着近年来对Breg细胞研究的不断深入，许多新的Breg细胞亚型和Breg细胞介导的抑制免疫反应的机制逐渐阐明。虽然越来越多的Breg细胞亚型被相继发现，但是对于Breg细胞的独特表型和特异性标志物并未明确。相对于动物模型的广泛研究，Breg细胞在临床疾病中的研究还有待加强，并且Breg在相关疾病的作用机制并未明确。因此，应进一步加强对Breg细胞生物学和相关临床疾病的研究，以更好地用于免疫相关性疾病的临床治疗。