气管支气管结核患者治疗前后支气管灌洗液中TNF-α、IFN-γ、IL-6水平观察

陈俊，袁保东，彭孝红，姚芳，李佺，陈国玺，兰星

(武汉市肺科医院，武汉 430030)

近年来全世界结核疫情严重，结核感染率及发病率均升高。2015年全球新增结核患者约10 400万，约1 800万例患者死亡，我国为全球新发结核病例最多的6个国家之一。气管支气管结核(TBTB)是结核病中危害最大、传染性最强、肺功能损害最重的一类结核病。TBTB治疗困难、疗程长，部分患者甚至出现耐药、结核复发、肺功能严重受损等。所以优化TBTB治疗方案并减少后遗症是结核治疗中的重点和难点。气道内免疫治疗可能成为新的突破点。有报道提出免疫因子TNF-α、IFN-γ、IL-6可作为结核感染后的有效生物标志物[1～3]，在对结核分枝杆菌(简称Mtb)的免疫应答中扮演着重要角色。本文通过检测TBTB患者支气管灌洗液中细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6)水平，分析它们在TBTB发病及转归中的变化，探讨这些细胞因子在TBTB病程中所起到的免疫调节作用及意义，为TBTB的气道内免疫治疗提供理论依据,进一步优化TBTB治疗方案。

1 资料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 TBTB组 选取我院2016年1～12月明确诊断的40例TBTB住院患者作为TBTB组。TBTB组男22例、女18例，年龄(36.75±12.45)岁，吸烟11例，有既往病史12例(糖尿病4例、慢性胃炎2例、乙肝病毒携带2例、胃大部切除1例、慢性咽炎1例、合并小儿麻痹症后遗症1例、有肺结核病史者1例)。TBTB诊断依据2012年气管支气管结核诊断和治疗指南[4]。纳入标准：所有TBTB患者治疗前痰结核菌涂片(STB)、痰结核菌培养(人型分枝杆菌，CTB)均阳性，CTB药敏无耐药，纤维支气管镜(简称纤支镜)检查提示气管、支气管结核(病变累及主支气管、叶、段支气管，部分患者病变累及主气管)，灌洗液普通细菌培养、霉菌涂片和培养均阴性，血清降钙素(PCT)正常。TBTB组患者接受抗结核治疗及异烟肼联合地塞米松雾化吸入治疗。所有患者定期随访，治疗2月末患者痰STB均转阴，纤支镜检查提示气管、支气管病变明显好转，肺部影像学较前吸收。治疗前及治疗1、2、6月，纤支镜检查时留取支气管灌洗液。

1.1.2 菌阴组 选取同期住院诊断为菌阴肺结核患者40例(均为健康体检时发现)作为菌阴组。菌阴组男21例、女19例，年龄(34.13±11.42)岁，吸烟13例，有既往病史6例(糖尿病3例、慢性胃炎1例、乙肝病毒携带2例)。入选标准：3次STB及1次CTB均阴性，常规抗感染治疗无效，临床排除其他非结核性肺部疾患。胸部CT检查符合典型结核影像学特征(经两位胸科影像学专家共同阅片证实)。结核菌素试验(+++～++++)，T-spot阳性。纤支镜检查证实气道无明显异常(经两位纤支镜专职医生认同)，选取病灶相应肺段行支气管灌洗留取标本。受试者1个月内无明显呼吸道感染史,既往无心肺疾病和过敏性疾病史，纤支镜灌洗液普通细菌培养、霉菌涂片和培养均阴性，PCT正常。菌阴组患者接受诊断性抗结核治疗并随访观察，抗结核治疗2月，肺部影像学较前吸收好转，诊断性治疗有效。

1.1.3 对照组 选取同期住院行纤支镜检查的纵隔淋巴结结核患者8例、可疑纵隔肿瘤2例为对照组。对照组男6例、女4例，年龄(42.40±13.08)岁，吸烟5例，有既往病史4例(乙肝病毒携带2例、糖尿病1例、白细胞减少1例)。入选标准：胸部CT检查肺部无实质性病变(经两位胸科影像学专家共同阅片证实)，纤支镜检查证实气道无明显异常(经两位纤支镜专职医生认同)；受试者术前1个月内无呼吸道感染史,既往无心肺疾病和过敏性疾病史；纤支镜灌洗液普通细菌培养、霉菌涂片和培养均阴性，PCT正常；3次STB及1次CTB均阴性。纤支镜检查时选取同一肺段(右上支气管)行支气管灌洗留取标本。

三组性别、年龄、吸烟比例、有既往史比例比较P均>0.05。本研究经医院医学伦理委员会审批，患者知情同意。

1.2 支气管灌洗液TNF-α、INF-γ、IL-6检测 各组纤支镜检查时，每次灌洗10 mL(生理盐水)，共3次，尽量回抽灌洗液留取标本，低温离心(2 000 r/min)，留取上清，置-80 ℃冰箱保存待测。采用ELISA法检测TNF-α、IL-6、INF-γ，试剂均购自上海沪鼎生物科技有限公司,按说明书操作。

2 结果

TBTB组治疗前后及菌阴组、对照组支气管灌洗液TNF-α、INF-γ、IL-6水平比较见表1。

3 讨论

TBTB是发生在气管、支气管黏膜、黏膜下层平滑肌、软骨及外膜的结核病[4]，属于下呼吸道结核病，严重影响气道结构及功能。

表1 TBTB组治疗前后及菌阴组、对照组支气管灌洗液

注：与菌阴组及对照组相比，*P<0.05；与本组治疗前相比，△P<0.05；与本组治疗1月相比，○P<0.05；与本组治疗2月相比，●P<0.05。

在TBTB发生发展过程中，有多种细胞因子参与了气道内的免疫应答及其病理过程。有研究[2,3,5]发现，在结核患者的血清、胸腔积液以及实验动物的支气管肺泡灌洗液中均可检测出TNF-α、IFN-γ、IL-6，提出这些因子可作为结核感染后的有效生物标志物。预防结核感染的AERAS-402气溶胶疫苗接种引起恒河猴强大的细胞免疫应答，在实验动物肺泡灌洗液中发现特异性CD4及CD8效应性T细胞，并产生大量细胞因子，如IFN-γ、TNF-α等[6]。但目前国内外尚无TBTB患者支气管灌洗液中TNF-α、IFN-γ、IL-6水平研究的报道。

TNF-α是一类由激活的巨噬细胞、淋巴细胞等所分泌的细胞因子，有广泛的生物学活性，能促进巨噬细胞的吞噬功能并有利于清除胞内Mtb，促进机体产生有效的肉芽肿应答。Dorhoi等[7]发现，超高水平的TNF-α与结核病变加重相关，所以TNF-α起到保护性免疫和致炎的双重作用，TNF-α表达的波动可以明显影响疾病的病程。TNF-α亦可诱导内皮细胞和巨噬细胞释放IL-6，并调控早期IL-6的产生[8]，形成因子之间相互促进、复杂的协同作用。本研究发现，TBTB组治疗前支气管灌洗液中TNF-α较菌阴组、对照组明显升高，TNF-α产生增多有利于激活多种免疫细胞及因子，促进机体清除结核感染。Navarra等[9]研究发现，在亚洲结核病流行地区，接受TNF-α拮抗剂治疗的患者结核患病风险增加。TBTB组患者治疗2月时气管、支气管病变明显好转，肺部影像学较前吸收，TNF-α检测值下降，与疾病恢复一致。Shameem等[10]研究发现，在耐多药肺结核(MDR-TB)患者中，血清TNF-α水平明显高于其他结核病患者，建议将TNF-α作为MDR-TB患者对二线抗结核药物治疗有效的指标。因本文未纳入MDR-TB患者，若支气管灌洗液中TNF-α持续升高，我们是否需要警惕MDR-TB可能，有待进一步的研究。

IFN-γ主要由活化的Th1细胞产生，它可以促进巨噬细胞活化、清除胞内Mtb,提高组织相容性复合物Ⅱ(MHC-Ⅱ)分子表达，促进抗原识别[11]。IFN-γ水平的高低可区分活动性和潜伏结核感染[12]。目前广泛开展的t-spot检测技术，可检测血清IFN-γ水平用于诊断结核病。本研究发现TBTB组治疗前支气管灌洗液中IFN-γ水平较菌阴组、对照组明显升高，提示IFN-γ升高与气道内结核感染相关。Adewole等[13]随访监测活动性肺结核患者在治疗前3月血清IFN-γ水平，发现治疗1月时较治疗前水平升高，治疗3月时血清IFN-γ明显降低。本研究发现在治疗1月时，TBTB组支气管灌洗液中IFN-γ较治疗前轻度升高，但差异无统计学意义，分析原因可能为有效的抗结核治疗导致Mtb大量死亡，死亡菌体抗原刺激淋巴细胞导致肺组织T淋巴细胞产生增加；其次为部分患者支气管结核较重，病初干酪坏死物堵塞气道，当支气管逐步通畅，灌洗液中IFN-γ检测值较前升高。随着病情好转恢复，患者于治疗2月IFN-γ水平明显下降，治疗6月时与对照组比较差异无统计学意义。

IL-6在炎症及免疫反应中起到多效应性作用，并促进结核感染后有效的宿主免疫反应。其作用机制为促进T、B细胞成熟，介导急性炎症反应。Lopes等[14]研究发现，IL-6能刺激早期IFN-γ的产生,IL-6基因敲除小鼠IFN-γ产生低，提示IL-6在对Mtb的保护性反应中起关键作用。IL-6水平升高可增强组织细胞对TNF-α的敏感性。而另一方面，IL-6又可下调巨噬细胞杀微生物活性，抑制INF-α的产生，由Mtb感染的巨噬细胞分泌的IL-6可抑制未感染的巨噬细胞对IFN-γ的反应[15]。有研究表明，IL-6可能发挥多重效应，并对宿主控制Mtb感染产生影响。本文发现TBTB组治疗前支气管灌洗液IL-6水平明显高于菌阴组、对照组，但治疗1月后较治疗前明显下降，早于TNF-α、IFN-γ，考虑可能与IL-6免疫调节的双向性和复杂性相关，若IL-6水平持续升高，反而抑制受Mtb感染的巨噬细胞中IFN-γ诱导的自噬功能[16]，不利于炎症恢复，可导致组织坏死加重及MDR-TB。TBTB组患者治疗2月及治疗6月支气管灌洗液IL-6水平与菌阴组、对照组相比差异无统计学意义。Fatima等[17]研究发现，活动性肺结核和MDR-TB患者血清IL-6明显高于接受抗结核治疗的患者。本研究TBTB组患者抗结核治疗后支气管灌洗液IL-6水平也明显下降。

本研究不足之处：因均为痰菌阳性的支气管结核患者，支气管肺泡灌洗治疗有导致Mtb播散、病灶增多的风险，故纤支镜治疗留取标本均采用支气管灌洗，灌洗后尽量回抽留取标本，以免灌洗液流入其他叶段支气管导致细菌播散。其次需进一步探讨免疫细胞和细胞因子复杂的网络联系，更深层次了解免疫状况及机制。