ER阳性乳腺癌中FOXM1和GRP78蛋白表达与临床病理因素及预后的相关性研究*

李海东 ，赵四成 ，李季丹 ，陈 橼 ，王 健 ，黄向华 ，张一心 ，郭 燕

（1南通市妇幼保健院普外科，江苏226018；南通大学附属肿瘤医院2乳腺外科，3病理科）

女性乳腺癌的发病率已跃居女性癌症发病率的第一位，其中ER阳性乳腺癌占所有乳腺癌的75%～80%。尽管ER阳性乳腺癌患者行化疗辅助内分泌治疗效果较好，且总体预后佳，但仍有部分患者在治疗中出现耐药甚至复发转移。研究证明FOXM1在癌症的发生中与上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）有关[1]，GRP78 在 ER 阳性的乳腺癌细胞中高表达[2]，且与EMT有一定的相关性[3-4]。本研究收集南通大学附属妇幼保健院及附属肿瘤医院2007年1月—2011年12月收治的ⅠB期-ⅢA期（pT3N1M0）ER阳性乳腺癌患者60例（肿瘤医院40例），旨在探讨ER阳性乳腺癌组织中FOXM1和GRP7表达情况及其与临床病理参数的相关性，以及对ER阳性乳腺癌患者预后的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 ⅠB期-ⅢA期（pT3N1M0）ER阳性乳腺癌患者的石蜡组织60例，年龄34～75岁，平均57.4岁。入组条件：（1）女性；（2）术前均未经任何放化疗和免疫治疗；（3）术前排除肿瘤远处转移的可能；（4）行乳腺癌改良根治术的患者，且病理证实为ER阳性浸润性乳腺癌。患者临床病理资料见表1，平均无复发生存时间47.19±20.19月。本项目通过所在医院伦理委员会批准。

1.2 试剂、材料及方法 采用SP法，常规HE染色明确诊断。兔抗人FOXM1（ab83097）与GRP78（ab32618）多克隆抗体购自Abcam，工作液按1∶100稀释，辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗采购Dako Cytomation，USA，具体方法参照文献[5]。

1.3 免疫组化结果判定 根据着色的深浅评分，FOXM1或GRP78阴性，细胞不着色，记0分；弱阳性，细胞呈淡黄色，记1分；阳性，细胞呈棕黄色，记2分；强阳性，细胞呈深棕黄色，记3分。标记物敏感性评价：2～3分为高表达，0～1分为低表达。切片在光镜（50×）下进行图像分析（IPWIN60图像荧光分析软件），每张切片观察5个高倍视野，并分别测量细胞中FOXM1和GRP78表达的平均光密度值。评估方法及标准参照[5-6]。

1.4 统计学处理 所有数据应用SPSS 19.0统计学软件处理，采用Pearson进行相关分析，分析FOXM1和GRP78表达之间的相关性；应用χ2检验分析FOXM1和GRP78表达与临床病理参数之间相关性；单变量Cox比例风险回归分析患者的生存差异，单因素回归分析中的显著因素进一步纳入多因素回归分析；无复发生存期（RFS）采用Kaplan-Meier和Log-rank检验进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 FOXM1和GRP78在ER阳性乳腺癌中表达及相关性 60例ER阳性乳腺癌组织中，34例（56.67%）FOXM1高表达，阳性信号定位细胞核及细胞质中，33例（55%）GRP78高表达，阳性信号定位于细胞质中表达呈深褐色，但在癌旁组织中均为低表达（图1，表1）。将复染后的乳腺癌石蜡切片进行扫描，FOXM1和GRP78蛋白在乳腺癌组织中表达的平均光密度值散点图见图2，Pearson相关性分析发现二者呈中等相关，有统计学意义（r=0.51，P<0.001）。

图1 免疫组化检测FOXM1和GRP78在ER阳性乳腺癌表达

图2 ER阳性乳腺癌GRP78与FOXM1表达相关性

2.2 FOXM1和GRP78高表达与临床病理相关性GRP78表达水平与脉管侵犯、Ki67有关，FOXM1表达与组织学分期（G 期）、脉管侵犯、Ki67、HER-2之间有关，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3 Kaplane-Meier生存分析 FOXM1高表达与低表达患者（30.50 m vs 85 m）（图 3a），GRP78高表达与低表达患者（72 m vs 78 m）（图3b）术后RFS差异具有统计学意义（P<0.05）；FOXM1、GRP78共同高表达与FOXM1、GRP78共同低表达患者（30.5 m与89.5 m）RFS的差异具有统计学意义（P<0.05）（图3c，d）。

2.4 FOXM1与GRP78表达对术后5年RFS的影响 单因素回归分析发现，患者5年RFS与脉管侵犯（HR=0.456，P=0.044）、FOXM1 高表达（HR=0.362，P=0.004）、GRP78 高表达（HR=0.379，P=0.012）、Ki67高表达（HR=0.334，P=0.016）、HER2高表达（HR=10.07，P＜0.001）有关，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步多因素回归分析显示，患者5年RFS与患者HER-2表达（HR=6.091，P=0.003）有关，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 2。

表1 GRP78和FOXM1在ER阳性乳腺癌患者中的表达情况 n（%）

图3 FOXM1和GRP78的表达与ER阳性BC患者术后RFS生存率的关系

3 讨 论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，我国每年新增乳腺癌27.27万例，其中ER阳性乳腺癌占所有乳腺癌的75%～80%[7]。ER阳性型乳腺癌治疗手段多种多样，除手术外还包括内分泌治疗、细胞毒性治疗、放疗以及靶向治疗。尽管如此，长期服用内分泌药物导致的各种不良反应使得多数患者无法耐受，部分患者停止服药后发生肿瘤复发、转移，何时停止服用内分泌药物成为乳腺癌防止复发的关键，甚至有些患者在术后内分泌治疗期间出现耐药甚至发生复发转移。寻找特异性分子标志物对提高ER阳性乳腺癌治疗效果十分迫切。

表2 单因素和多因素回归分析影响ER阳性乳腺癌患者RFS的相关因子

FOXM1是叉头框（fork head box，FOX）家族成员之一，是细胞周期的重要调控因子。FOXM1蛋白由3个功能区组成，包括一个N-末端自动控制域（N-terminal autorepressor domain，NRD），一个保守的DNA结合域（conserved fork head DNA binding domain，DBD）和C-末端的一个转录激活域。FOXM1在增殖的细胞中高表达，但在静止和分化成熟的细胞中几乎无法检测到。FOXM1是典型的增殖相关转录因子，调节细胞周期G1期和G2期，维持有丝分裂纺锤体完整性[1]，还参与细胞周期循环和组织再生。有研究证明FOXM1在癌症发生中起着重要的作用，包括直接参与肿瘤血管生成、增殖、迁移、浸润、上皮-间质转化（EMT）、转移、早期细胞衰老的预防与化疗药物耐药的产生[1]。

GRP78作为一种分子伴侣，在内质网、细胞质、细胞膜中协助蛋白质的折叠和转运，参与UPR信号的激活，从而发生未折叠蛋白应答（UPR），激活UPR的三条信号转导通路：IRE-1通路、ATF6通路和PERK通路而发挥作用。有研究发现GRP78能促进细胞增殖和迁移，抑制细胞Bcl-2表达水平，从而抑制细胞凋亡。GRP78与激活的凋亡上游因子caspase-7结合，阻止caspase-7的分解和抑制细胞的凋亡，达到促进细胞生长的目的[8]。研究认为，GRP78抑制乳腺癌细胞凋亡过程，从而影响乳腺癌患者化疗效果和预后[9]。细胞外基质（ECM）增加和EMT与乳腺癌化疗耐药相关[3，10]，GRP78在ER阳性乳腺癌细胞中高表达[2]，可能与ECM的积聚和EMT有关[11-12]。

有研究显示在乳腺癌中，HER-2调节FOXM1的表达[13]。郑州大学研究团队发现在肠癌细胞株SW1116和LOVO中FOXM1与GRP78表达呈显著正相关，FOXM1对大肠癌细胞迁移和侵袭的促进作用可因GRP78的缺失而明显减弱，且FOXM1促进结直肠癌细胞表面GRP78表达[14]。我们猜想HER-2可能是FOXM1-GRP78信号通路的上游因子，控制FOXM1和GRP78的表达，具体机制待进一步研究。

本研究结果显示，FOXM1和GRP78在ER阳性乳腺癌癌组织中高表达，癌旁组织中低表达，二者表达呈正相关性；GRP78表达与脉管侵犯、Ki67有关，FOXM1表达与G期、脉管侵犯、Ki67、HER-2有关；GRP78和FOXM1高表达均是影响ER阳性乳腺癌患者RFS的因素。提示FOXM1-GRP78信号通路有可能作为新的乳腺癌分子靶点，用于设计新的治疗方案来控制肿瘤的转移和进展。