新疆塔城地区乳源酵母菌的分离、鉴定及其抗胁迫特性

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(1.石河子大学食品学院,新疆石河子 832000;2.新疆西部牧业股份有限公司,新疆石河子 832000)

塔城地区位于亚欧大陆腹地,属于中温带干旱和半干旱气候区。这里世代居住着游牧民族,他们一直保留着以手工制作,运用传统方法制做奶酪的工艺,使得新疆传统发酵奶酪具有很鲜明的地域特色[1]。新疆传统发酵奶酪中含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、微量矿物质元素营养成分及生物活性成分[2-3]。

在奶酪的自然发酵过程中,酵母菌在奶酪成熟过程中起到至关重要的作用[4]。酵母菌作为发酵菌群的一部分,在乳酸盐的同化、碱性代谢物的生成、细菌生长因子的释放、乳糖的发酵、脂肪的分解、蛋白质水解、芳香化合物的形成等起着不可或缺的作用[5]。同时在自然发酵过程中,酵母常常会受到高温条件[6-7]、高渗透压条件[8]、高乙醇[9]含量等的影响,具有较好的耐受性得到广泛关注。Techaparin等[10]在湄公河流域筛选出的酿酒酵母和毕赤酵母耐受43 ℃及13%酒精,乙醇生成浓度可达到89.32 g/L。Díaz-Nava等[11]筛选出毕赤酵母发酵力20 g/L糖浓度,能够耐受高渗透压胁迫,Qvirist[12]发现所筛选的马克思克鲁维酵母和毕赤酵母能耐受高温和低pH,Koutinas等[13]将耐高温毕赤酵母菌用以发酵果皮。

近年来，工业化发酵乳制品的生产、消费逐渐向牧区渗透,部分牧民已开始放弃传统发酵乳制品的生产工艺和方法,导致发酵乳制品的产品种类、风味和菌种呈现单一化趋势[14],不利于我国乳制品多样化发展。本实验以新疆塔城牧民自产的传统奶酪为原料,采用形态学、生理生化特征、5.8S rDNA序列同源性分析相结合的方法对所筛酵母菌的归属进行了鉴定,并考察了耐酸、耐胆盐、耐高温、耐渗透压、耐高温等条件下存活能力。本实验筛选能够在人体环境下存活并且耐受能力良好的菌株,通过收集和保护新疆特色酵母菌资源,为新疆乳品多元化发展提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新疆哈萨克族自制奶酪 新疆塔城地区牧场;酵母菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型) 天根生化科技有限公司;2x Taq PCR MasterMIX 天根生化科技有限公司:引物ITS 1与ITS 4 上海生工生物工程有限公司;脱脂乳粉培养基 脱脂乳粉12 g,水100 mL;麦芽培养基 麦芽浸粉130 g,水1000 mL;酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(Yeast extract peptone dextrose medium,YEPD) 蛋白胨10 g,葡萄糖20 g,酵母浸粉5 g。

W-CJ-1Cg超净工作台 苏州净化设备有限公司;DNP-9272电热恒温培养箱 上海精宏试验设备公司;5417R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;TC-512聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增仪 美国Techne公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酵母菌的分离与纯化 取1 g奶酪样品,溶于150 mL脱脂乳粉液体培养基中,采取稀释涂布平板法涂于麦芽培养基中进行分离,平板置于28 ℃培养箱中培养48 h,观察并记录菌落特征,挑选出不同形态的单一菌落,进行革兰氏染色,观察细胞形态,重复几次纯化酵母菌,直到镜检结果为同一细胞形态后,将其接种于YEPD固体斜面培养基上,28 ℃培养48 h后,于4 ℃保藏备用。

1.2.2 酵母菌的生理生化特性鉴定 酵母菌分离菌株主要通过繁殖方式观察、糖发酵实验、碳源同化实验、氮源同化实验等生理生化特征进行实验[15]。

1.2.3 酵母菌的5.8S rDNA分析

1.2.3.1 酵母菌基因组DNA的提取 将1.2.1中纯化的酵母菌接种于YEPD液体培养基中置于28 ℃培养36 h后,取1 mL活化菌液4 ℃下12000 r/min离心1 min,收集沉淀即为菌体。按照酵母菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)说明书上的方法进行操作,然后将所提取的DNA于-20 ℃保存。

1.2.3.2 5.8S rDNA PCR扩增 将1.2.3.1中制备的基因组DNA作为PCR扩增的模板,使用引物ITS 1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS 4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对5.8S-ITS区域酵母菌DNA进行扩增;采用50 μL反应体系:DNA模板2 μL,ITS 1(10 μmol/L)2 μL,ITS 4(10 μmol/L)2 μL,2xTaq PCR MasterMix 25 μL,加ddH2O补至50 μL。

1.2.3.3 扩增产物测序及系统发育分析 PCR产物经电泳检验合格后,将扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测得序列在美国国家生物技术信息中心(National center for biotechnology information,NCBI),利用BLAST软件在GenBank核算序列数据库中进行相似序列搜索,比较测序菌株与已知酵母菌相应序列的同源性[16]。

1.2.4 试验酵母菌的选择 取活化36 h的酵母菌株200 mL分别接种于含量有0.3%(v/v)猪胆盐和pH2.0的YEPD液体培养基,置于28 ℃,150 r/min有氧培养,培养3 h后取出样品,适当稀释涂布于YEPD琼脂平板上,在28 ℃下培养48 h后计数,得到菌落数(Colony forming units,CFU)。根据存活率选出对胆盐和低pH具有强、中耐受性的菌株。

1.2.5 试验酵母菌的活化 将1.2.1中保藏备用的菌种接种于YEPD液体培养基中,于28 ℃,150 r/min有氧培养24 h,对试验酵母菌活化备用。

1.2.6 不同胆盐浓度对试验酵母菌生长曲线的影响 酵母菌株在YEPD液体培养基中28 ℃培养到OD600为1.0,离心收集细胞(6000 r/min 2 min,4 ℃),以磷酸缓冲液(50 mmol/L,pH6.0)清洗两次,然后将细胞置于胆盐质量分数为0.2%、0.3%、0.4%的YPED液体培养基三角瓶中,置于28 ℃,150 r/min有氧培养48 h。在前24 h,每3 h取样一次,在后24 h,每6 h取样一次。测定样品的OD600。以时间为横坐标,OD值为纵坐标,绘制生长曲线。

1.2.7 试验酵母菌体外胁迫特性研究

1.2.7.1 耐高温试验 将1.2.5中活化好的菌种接种于YEPD液体培养基中,接种量为4%(v/v)。分别在28、37、42 ℃下培养48 h,进行菌落计数[17],与空白对照组(培养温度为28 ℃)对比,观察其耐受性。

1.2.7.2 耐渗透压试验 将活化好的菌种接种于添加氯化钠的YEPD液体培养基中,添加氯化钠的质量分数分别为0(空白组)、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%的YEPD液体培养基中,接种量为4%(v/v)。在28 ℃下培养48 h后,进行菌落计数[17],观察其耐受性。将活化好的菌种接种于添加葡萄糖的YEPD液体培养基中,葡萄糖的添加量为0(空白组)、10、20、30、40、50 g/100 g的液体YEPD培养基中,接种量为4%。在28 ℃下培养48 h后,进行菌落计数[17],观察其耐受性。

1.2.7.3 乙醇耐受试验 将活化好的菌种接种于添加无水乙醇的YEPD液体培养基中,添加无水乙醇的体积分数为0(空白组)、4%、8%、12%、16%、20%的液体YEPD培养基中,接种量为4%(v/v)。在28 ℃下培养48 h后,进行菌落计数[17],观察其耐受性。

1.3 数据处理

本实验实验数据处理采用SPSS 19.0版本,采用MAGE 5.0和Origin 7.5进行绘图。

2 结果与分析

2.1 酵母菌的分离纯化与鉴定

酵母菌在YEPD固体培养基分离纯化后,共分离出34株酵母菌,酵母菌菌落形态结果如表1所示,细胞形态及繁殖方式如表2所示,理化鉴定结果如表3所示,碳源、氮源同化鉴定结果如表4所示。采用结合传统形态学、生理生化特性方法对酵母菌进行鉴定,依据《酵母菌的特征与鉴定手册》和《食品微生物实验技术》[18-21],鉴定结果为:A2-1、A2-4、A2-11、A3-2、A3-6、A4-4、A4-5、A4-6、A5-2、A5-13、A7-5、A7-6、和W7-3为毕赤酵母属(Pichia);A2-6、A3-3、A6-3、W6-2、H7-4为有孢圆酵母属(Torulaspora);部分菌株仅仅依据生理生化结果无法做出判断。

表1 酵母菌的菌落形态结果Table 1 Results of yeast colony morphology

续表

表2 酵母菌细胞形态和繁殖方式Table 2 Yeast cell morphology and reproductive modes

表3 酵母菌的理化性质鉴定结果Table 3 Identification results of physiological and biochemical properties of yeasts

表4 碳源、氮源同化鉴定结果Table 4 Identification results of carbon assimilationand nitrogen assimilation experiment

2.2 酵母菌系统发育分析

34株酵母菌ITS分子生物学鉴定结果如表5所示。从表5中可以看出,34株酵母菌共被鉴定属于6属7种,其中库德毕赤酵母为样品中优势菌种,占比为47.05%;较多的还有戴尔有孢圆酵母和美极梅奇酵母。将全部菌种序列数据号在NCBI中进行比对,构建系统发育树,如图1所示。

图1 34株酵母菌的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of 34 yeast strains

表5 34株酵母菌ITS鉴定结果Table 5 Identification results of ITS sequence of 34 yeast strains

图1可知。菌株A2-13、A6-6、A4-3和W4-6与标准菌株同源性相似率低于99%,不能为同一种[17],结合生理生化鉴定结果,可以判定菌株A2-13和A6-6为马克思克鲁维酵母菌,菌株A4-3和W4-6为乳酸克鲁维酵母。其余酵母菌同源性均在99%以上,表示其具有较近的亲缘性。王文磊等[22]从蒙古奶酪中分离出株酿酒酵母,3株马克斯克鲁维酵母,2株班图酒香酵母,3株膜醭毕赤氏酵母。李艳等[23]从内蒙古牧区分理出马克思克鲁维酵母菌、隐球酵母菌、酿酒酵母菌、热带假丝酵母菌、陆生伊萨酵母菌和季也蒙毕赤酵母菌。由此看来,本研究分离的酵母菌具有不同的菌种种类,可能与当地的地理位置、外部环境有关[24]。从34株酵母菌中挑选出生长旺盛、生理生化特性比较典型的7株酵母菌(A1-2、A2-1、H2-3、A2-6、H2-6、A2-13、A4-3)进行下一步实验。

2.3 耐酸耐胆盐酵母菌的筛选

酵母菌存活率如图2所示。从图2中可以看出，所有菌株中,A2-1菌株和H2-3菌株在0.3%猪胆盐存活率最高,H2-6菌株和A4-3菌株在pH2.0条件下存活率最高,但菌株H2-3和W2-3在低pH条件下无法存活。为了挑选出对低pH和耐胆盐具有良好耐受性的菌株进行后续实验,所以选择了A2-1和A2-13作为下一步试验菌株。

图2 7株酵母菌耐酸耐胆盐存活率Fig.2 Acid and bile salt survival rate of 7 yeast strains

2.4 试验酵母菌耐胆盐生长曲线

酵母菌在不同胆盐浓度中生长情况,结果如图3所示。从图3中可以看出,胆盐浓度会对菌株生长产生明显的抑制作用。在加入胆盐后,会对2株菌株均会产生一定时间的迟滞期,但受影响的程度不同,其中菌株A2-13迟滞期更加明显。当胆盐浓度为0.4%时,菌株A2-13的生长受到严重抑制,相对于菌株A2-1,菌株A2-13耐胆盐的能力较弱。

图3 胆盐浓度对两株酵母菌生长的影响Fig.3 Effect of bile salt on growth of 2 yeast strains

2.5 试验酵母菌体外胁迫特性研究

2.5.1 耐高温试验 酵母菌在不同温度条件下生长情况结果见图4。从图4中可以看出,两株菌在28 ℃(CK组)时生长情况优于37 ℃,但两株菌在42 ℃高温条件下良好生长。菌株A2-1比A2-13更不耐高温,随着温度升高,死亡率升高(p<0.05)。上述结果表明,不同属酵母菌之间耐高温的能力不同。A2-13菌株比刘超帝[25]、卜文静[26]、谭才邓[27]、石娇娇[28]等筛选耐高温酵母菌更能耐高温,其相较A2-1更具有应用于生产、解决现实生产存在问题的价值。

图4 菌株对不同温度耐受比较Fig.4 Tolerance to different temperatures for yeast strains注:A、B、C和a、b、c、e表示标有不同字母的组分间有显著性差异,p<0.05。

2.5.2 耐渗透压试验

2.5.2.1 耐盐试验 酵母菌在不同盐浓度条件下的生长情况结果见图5。由图5可知,随着NaCl浓度的增加,两株酵母菌的生长情况出现下降,受到明显抑制(p<0.05),但NaCl浓度由0.8%增加到1.2%时两株酵母菌生长发育没有受到明显抑制(p<0.05),当达到1.6%NaCl浓度时,菌株A2-1受到明显抑制,而菌株A2-13表现出更好的耐盐性能,在2.4%NaCl浓度的情况下,菌落总数依然能保持在108个,具有很好的耐高盐潜力。与乌日娜等[29]、柴洋洋等[30]的研究结果相比,相同盐浓度水平表现相当,但当盐浓度大于2.4%时,两人所筛选菌株强于A2-1和A2-13。

图5 菌株对不同浓度氯化钠耐受比较Fig.5 Tolerance to different concentrations of NaCl for yeast strains注:A、B、C、D和a、b、c、d、e表示标有不同字母的 组分间有显著性差异,p<0.05。

2.5.2.2 耐糖试验 酵母菌在不同糖浓度条件下的生长情况结果见图6。由图6可知,随着糖浓度的不断增加,两株菌的数量逐渐减少,与耐盐实验基本吻合,且菌株A2-13的耐高糖能力优于菌株A2-1。在糖浓度为10%～30%情况下,菌株A2-13没有显现出更进一步受到抑制(p>0.05),当糖浓度增加至40%时,表现出明显的抑制作用(p<0.05)。与贾春凤等[31]、兰钊等[32]所筛选的耐高糖酵母菌相比,菌株A2-1和A2-13耐高糖能力优良,在糖浓度为50 g/100 g时，依旧能达到3.63×106和2.51×107CFU/mL。

图6 菌株对不同含量葡萄糖耐受比较Fig.6 Tolerance to different concentrations of glucose for yeast strains注:A、B、C、D、E、F和a、b、c、d、e表示标有不同字母的 组分间有显著性差异,p<0.05。

2.5.3 耐乙醇试验 酵母菌在不同乙醇浓度条件下的生长情况结果见图7。由图7可知,乙醇含量逐渐增加,两株酵母菌的细胞数逐渐降低,酵母菌的生长、发育与繁殖受到显著的影响(p<0.05),菌株A2-1在乙醇含量达到16%时无法生存,而菌株A2-13虽然明显被抑制,但是细胞总数能达到105个,乙醇耐受性能优于菌株A2-1。当培养基中乙醇含量高达20%时,两株酵母菌完全受到乙醇的抑制作用,无法生存。A2-13能在16%乙醇含量条件下能够达到2.00×105CFU/mL,与隋玉洁等[33]、赖颖等[34]研究相比,与其所筛耐乙醇酵母菌耐乙醇能力相当,A2-1耐乙醇能力相较较弱。

图7 菌株对不同浓度乙醇耐受比较Fig.7 Tolerance to different concentrations of alcohol for yeast strains注:A、B、C、D、E、F和a、b、c、d、e、f表示标有不同字母的组分间有显著性差异,p<0.05。

3 结论

本实验对新疆塔城地区8个牧场采集的奶酪样品中分离出34株酵母菌,利用传统形态学、生理生化特征方法、分子生物学鉴定,筛选出共6属7种酵母菌,分别被鉴定为库德毕赤酵母菌(47.05%)、戴尔有孢圆酵母(17.65%)、美极梅奇酵母菌(11.76%)、马克思克鲁维酵母(5.88%)、酿酒酵母(5.88%)、胶红酵母(5.88%)、乳酸克鲁维酵母(5.88%),其中库德毕赤酵母菌为优势菌株。

在耐受性胁迫实验中,库德毕赤酵母菌A2-1能够耐受42 ℃高温、2.4%高盐胁迫、50 g/100 g高糖胁迫以及12%酒精胁迫;马克思克鲁维酵母菌A2-13能够耐受42 ℃高温,2.4%高盐胁迫、50 g/100 g高糖胁迫以及16%酒精胁迫。两株菌耐受能力良好,可以在人体环境下存活,而对高温、高渗透、高乙醇胁迫,两株酵母菌都表现出较好的耐受能力。对两株耐胁迫菌株的研究,收集和保护了新疆特色酵母菌资源,为新疆乳品多元化发展提供支持。