米根霉和乳酸菌混合固态发酵大麦仁工艺优化及其抗氧化活性

, ,,,,,

(黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆 163319)

大麦营养丰富,除蛋白质含量较高外,还有丰富的膳食纤维、维生素及矿物质元素。其营养成分总指标符合现代营养学所提出的高纤维、高维生素、高植物蛋白、低糖及低油脂的“三高两低”新型功能食品的要求[1-2]。此外,大麦还能改善消化不良、促进肠道蠕动、减轻便秘,尤其适合中老年人食用[3]。然而,正是由于大麦富含纤维素和蛋白质,所以无论是加工制粉或是其他产品,都存在一定的适口性问题,这也是制约其发展的主要因素之一[4-5]。开发新型功能性大麦食品,不仅可以提高大麦的食品加工利用率,为大麦的综合有效利用提供科学理论依据,还可为改善国民的健康状况做出贡献。近年来谷物发酵食品的逐渐风靡,为我们提供了一条开发功能性大麦食品的新途径。

微生物发酵不仅可以赋予谷物新的风味和质地,还可以改善其生理活性。Feng等[6]利用少孢根霉和酵母菌对大麦进行固态发酵,发现发酵并不影响氨基酸的含量和成分,也不会降低肌醇六磷酸酯的含量,但是却能够增加维生素B6和烟酰胺的量。Xiao等[7]也发现经蛹虫草发酵后的燕麦的抗氧化能力获得明显提升。乳酸菌因其公认的安全地位,其相应的发酵食品近年来更是备受关注。然而,乳酸菌的淀粉酶和蛋白酶活力相对较低,因此乳酸菌发酵食品多以液态发酵为主,如乳酸菌大麦饮料[8]。但液态发酵存在产率较低、产品运输困难和投资成本高等多种问题,这严重阻碍了大麦的大规模利用。而固态发酵可以很好地解决这些问题。有研究表明利用微生物混合发酵法能够有效促进乳酸菌在固态基质中的生长[9]。Feng等[10]研究表明在少孢根霉存在下,植物乳杆菌(L.plantarumSR3.60)、发酵乳杆菌(L.fermentumATCC 14931)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteriDSM 20016)和乳酸乳杆菌(L.lactisSR3.53)可以在固态大麦基质中良好生长。同时,在乳酸菌的作用下,大麦含有的多酚类物质可以由结合态转化为游离态,从而使发酵产物的多酚含量明显增加,进而增加其抗氧化活性[11]。因此,利用乳酸菌和霉菌混合固态发酵生产大麦发酵食品不仅具有理论可行性,还具有很好的开发前景。

米根霉作为传统固态发酵的优势菌种,其发达的淀粉和蛋白酶体系可以为乳酸菌的生长提供必需的小分子糖类和氨基酸。通过米根霉和乳酸菌混合发酵，既能赋予产品醇香和酸甜的风味,又可以达到增加乳酸菌的目的,从而进一步提升产品的功能特性。考虑到种皮的存在不利于微生物,尤其是乳酸菌的生长和发酵,本文采用大麦仁为原料,通过单因素实验和正交试验来确定米根霉和乳酸菌混合固态发酵大麦仁的最佳工艺,同时对产品的体外抗氧化活性进行分析,从而为大麦功能性食品的开发提供新的思路和研究方向。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大麦仁 大庆市北京华联超市;植物乳杆菌发酵剂 常州益菌加生物科技有限公司;米根霉(安琪甜酒曲) 安琪酵母股份有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;1,10-菲咯啉、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS) 合肥博美生物科技有限责任公司;H2O2、NaOH、没食子酸、3,5-二硝基水杨酸等常规化学试剂 均为国产分析纯。

FA1104A型分析天平 上海垒固仪器有限公司;TD5A型离心机 长沙英泰仪器有限公司;C21-SC821型电磁炉 九阳股份有限公司;722S型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;303A-2型电热恒温培养箱 菏泽市石油化工学校仪器设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 大麦仁发酵工艺流程 大麦仁→清洗→浸泡→水煮→冷却→接种→恒温发酵→成品

操作要点:称取适量大麦仁,清洗后添加适量自来水室温浸泡。沸水蒸煮至熟透,待大麦仁沥干放凉后,分别添加0.5%(w/w)的米根霉和0.15%(w/w)的植物乳杆菌干粉发酵剂,料水质量比为10∶1(沥干大麦仁∶凉开水),最后置于30 ℃培养箱内恒温发酵。

1.2.2 浸泡时间的确定 分别称取21份20.0 g大麦仁,标记后倒入烧杯中。每个烧杯加入100 mL蒸馏水后室温浸泡。每隔2 h取样测定吸水率,观察吸水膨胀状态,确定最佳浸泡时间。

吸水率(%)=(A1-Ao)/Ao×100

式中,Ao为大麦仁初始质量;A1为浸泡后吸干表面水分的大麦仁质量。

1.2.3 蒸煮时间的确定 取清洗后大麦仁200 g,添加适量自来水后室温浸泡8 h。浸泡结束后水煮,沸腾后每2 min检验一次。蒸煮时间选择以麦仁熟透且有弹性,有麦香,内无白心为准。

1.2.4 单因素实验 以总酸含量、还原糖含量以及感官得分为指标,研究发酵时间、接种量、接种比例与发酵温度对大麦仁发酵品质的影响。

1.2.4.1 发酵时间 分别称取0.5%(w/w,发酵剂与沥干大麦仁质量之比)的米根霉和0.15%(w/w,发酵剂与沥干大麦仁质量之比)的植物乳杆菌发酵剂,采用煮沸冷却自来水(沥干大麦仁质量10%)混匀后与大麦仁搅拌均匀。发酵温度30 ℃,发酵时间依次选择24、30、36、42和48 h,发酵结束后进行酸度甜度测定和感官评定,以感官评定得分为指标确定最佳发酵时间。

1.2.4.2 接种量 在上述优化时间基础上,设定米根霉接种量(w/w)依次为0.1%、0.25%、0.5%和1%,接种比例10∶1(米根霉∶乳酸菌,w/w),发酵温度30 ℃,发酵结束后进行酸度甜度测定和感官评定,以感官评定得分为指标确定最佳接种量。

1.2.4.3 接种比例 在上述优化时间和接种量基础上,设定接种比例(米根霉∶乳酸菌,w/w)依次为20∶1、10∶1、10∶2、10∶3和10∶4。发酵温度30 ℃。发酵结束后进行酸度甜度测定和感官评定,以感官评定得分为指标确定最佳接种比例。

1.2.4.4 发酵温度 在上述优化时间、接种量和接种比例基础上,设定发酵温度依次为26、28、30、32和34 ℃。发酵结束后进行酸度甜度测定和感官评定,以感官评定得分为指标确定最佳发酵温度。

1.2.5 正交试验设计 以发酵时间、接种量、接种比例和发酵温度为试验因素(分别以A、B、C、D 表示),以感官得分为指标进行正交试验,试验因素水平见表1,每组3个重复。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal test

1.2.6 总酸含量与还原糖含量的测定 总酸含量测定[12]:准确称取2 g样品,向其中加入10 mL无二氧化碳蒸馏水。研磨样品至匀浆后定容至25 mL。然后采用0.1 mol/L NaOH标准溶液进行滴定。总酸含量定义为1 g样品所含酸的百分含量,以乳酸%(w/w)计。

还原糖含量测定[13]:准确称取1 g样品,向其中加入50 mL蒸馏水捣研至匀浆。3800 r/min离心15 min,取上清液定容至250 mL作为样品待测液。然后吸取1 mL样品待测液,采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量。

1.2.7 感官评定 感官评定由本学院12名以上教师和学生进行,感官评分表见表2。最终评分为所有打分平均值。

表2 感官评定表Table 2 Table of sensory evaluation score

1.2.8 总酚及体外抗氧化活性分析

1.2.8.1 总酚提取及含量测定 大麦仁多酚的提取参考付晓燕等[14]的方法略作修改。分别将发酵36 h和接种后未发酵大麦仁采用真空冷冻干燥机冻干,然后使用粉碎机粉碎后过100目筛备用。分别称取发酵前后大麦仁冻干粉2.5 g,按料液比1∶10 (m/v)加入80%的乙醇溶液,置于50 ℃水浴中超声(315 W)提取4 h。之后将提取液于4 ℃、10000×g条件下离心15 min,将上清液于旋转蒸发仪上回收乙醇,浓缩样品,添加去离子水定容至25 mL待测。总酚的测定采用 Folin-Ciocalteau法进行测定[15],含量以没食子酸当量表示。

1.2.8.2 羟基自由基清除活性测定 采用Liu等[16]方法。取1 mL上述总酚提取液,依次加入1 mL 1,10-菲咯啉、1.5 mL 0.15 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.4)、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4和1 mL 0.01% H2O2,混合物于37 ℃反应30 min后测定536 nm处的吸光值。用去离子水代替样品作为空白对照。按以下公式计算羟基自由基清除率:

羟基自由基清除率(%)=(A1-Ao)/(A′-Ao)× 100

式中,Ao为对照实验的吸光度值;A1为样品实验的吸光度值;A′为以水代替H2O2和样品的吸光度值。

1.2.8.3 DPPH自由基清除活性测定 采用Wang等[17]方法。取2 mL总酚提取液与2 mL 0.4 mmol/L的DPPH溶液(80%甲醇溶解)混匀,室温下暗反应30 min后测定517 nm处的吸光度值。用去离子水代替样品作为空白对照。按下列公式计算DPPH自由基清除率:

DPPH自由基清除率(%)=(Ao-A1)/Ao× 100

式中,Ao为空白对照实验的吸光度值;A1为样品反应的吸光度值。

1.3 数据处理

实验数据均为3次重复实验结果的平均值,结果表示为平均值±标准偏差。采用SPSS 18.0软件对数据进行显著性分析,p<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 浸泡时间和蒸煮时间的选择

2.1.1 浸泡时间对大麦仁吸水率的影响 浸泡可使大麦仁吸水膨胀,便于后续蒸煮时淀粉充分糊化。由图1可知,大麦仁吸水率随浸泡时间增加而增大,0～4 h吸水率增长速率较快,4～8 h吸水率增长速率变缓,8 h后基本无变化(p>0.05),说明已经达到饱和状态。所以选择大麦仁浸泡时间为8 h,此时吸水率为55.87%±1.19%。

图1 浸泡时间对吸水率的影响Fig.1 Effect of soak time on water absorption注:不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

2.1.2 蒸煮时间对大麦仁熟度的影响 经过多次试验得出，大麦仁的最佳煮制时间为沸腾后继续水煮10 min,此时麦粒完全熟透,有弹性,有浓郁麦香,内无白心。所以后续煮制大麦仁都以10 min为标准。

2.2 单因素结果与分析

2.2.1 发酵时间对还原糖含量、总酸含量及其感官得分的影响 由图2可知,还原糖含量随发酵时间的增加先增大后减少,发酵36 h时达到最大值,为(18.49±0.25) g/100 g。导致这种现象的原因可能是发酵初始阶段，米根霉产生的淀粉糖化酶将淀粉转化为葡萄糖,还原糖含量升高,而随着还原糖含量的升高,米根霉、乳酸菌会快速增殖,从而大量消耗还原糖,还原糖含量随之逐渐降低;总酸含量在24 h后先减少后趋于稳定,在48 h达到最小值0.49%±0.01%。前期研究表明,发酵开始的前18 h,总酸含量随发酵时间的延长而增加。这是因为乳酸菌和米根霉在发酵初期大量分解并利用碳水化合物产生乳酸等有机酸,而18 h后总酸开始下降,这与崔春等[18]的研究结果较为一致,他们对米根霉和乳酸菌混合制曲的研究结果也表明，在发酵后期,大曲的总酸会发生下降,这可能是因为霉菌在发酵后期消耗利用了一部分有机酸;感官得分随发酵时间的增加先增大后减小,在接种量36 h时最高为(8.6±0.32)分。

图2 发酵时间对还原糖含量、总酸含量和感官得分的影响Fig.2 Effects of fermentation time on reducing sugar content,total acidity and sensory scores

2.2.2 接种量对还原糖含量、总酸含量及其感官得分的影响 由图3可知,还原糖含量随接种量的增加而增大,其接种量1%时达到最大值,为(19.73±0.1) g/100 g,可能是因为米根霉接种量的增加提高了淀粉糖化酶的含量,从而导致还原糖含量的提高;总酸含量随接种量的增加逐渐减小,在接种量1%时达到最小值0.36%±0.01%,造成这种结果的原因可能是米根霉数量的增加对乳酸菌造成了竞争性抑制;感官得分随接种量的增加先增大后减小,在接种量0.5%时达到最高为(8.7±0.25)分。

图3 接种量对还原糖含量、总酸含量和感官得分的影响Fig.3 Effects of inoculation doses on reducing sugar content,total acidity and sensory scores

2.2.3 接种比例对还原糖含量,总酸含量及其感官得分的影响 由图4可知,还原糖含量随接种比例的减小，先增大后减少,其最大值为接种比例10∶2时为(21.35±0.18) g/100 g;总酸含量随接种比例的减小先增加后减小,然后再增大，并在10∶3时达到最小值0.53%±0.01%,在10∶4达到最大值0.77%±0.03%;感官得分随接种比例的减小，先增大后减小,在10∶2时最高为(8.9±0.35)分。这表明接种比例对发酵大麦仁感官影响比较大,过大或过小,都不利于良好风味的形成。

图4 接种比例对还原糖含量、总酸含量和感官得分的影响Fig.4 Effects of inoculation proportion on reducing sugar content,total acidity and sensory scores

2.2.4 发酵温度对还原糖含量、总酸含量及其感官得分的影响 由图5可知，还原糖含量随发酵温度的升高，先增加后降低最后逐渐上升,30 ℃时还原糖含量达到最高为(21.3±0.14) g/100 g。这可能是因为26～30 ℃米根霉酶活力随温度的升高而增大,还原糖含量呈增长趋势,30～34 ℃米根霉酶活力随温度的升高而增小,还原糖含量有所下降;总酸含量随发酵温度的升高呈下降趋势,34 ℃时最低为0.45%±0.01%;感官得分随发酵温度的升高，先增大后减小,在32 ℃时达到最高为(9.1±0.45)分。温度太高大麦仁色泽发暗,米根霉产生黑色孢子,且表层硬度大,影响口感。

图5 发酵温度对还原糖含量、总酸含量和感官得分的影响Fig.5 Effects of fermentation temperature on reducing sugar content,total acidity and sensory scores

2.3 正交试验结果

正交试验分析结果显示(表3),对发酵大麦仁感官评分的影响大小顺序为因素C>D>A>B,最优组合为A2B2C3D2,即发酵时间36 h,接种量0.5%,接种比例10∶3,发酵温度32 ℃。

表3 L9(34)正交试验设计与结果Table 3 Experimental design and results of L9(34)orthogonal test

该条件下获得的发酵大麦仁呈淡黄色,表面有少量白色菌丝,有淡淡的酒香味,酸甜适口,软硬适中(见图6)。感官评定得分为(9.3±0.35)分,感官得分优于未优化工艺。因此大麦仁发酵最佳工艺参数为室温浸泡8 h,蒸煮10 min,发酵时间36 h,接种量0.5%,接种比例10∶3,发酵温度32 ℃。

图6 未发酵和发酵大麦仁照片Fig.6 Photos of unfermented and fermented dehusked barley注:A:未发酵;B:发酵。

2.4 总酚及抗氧化分析结果

多酚含量分析表明，发酵0和36 h大麦仁中总酚含量分别为(0.187±0.006)和(1.290±0.041) mg/g没食子酸当量,这可能是因为在发酵过程中,微生物淀粉酶和蛋白酶等水解酶的作用，使得与细胞结构结合的多酚物质得以释放[19]。

体外抗氧化活性分析表明(见图7),各样品对羟自由基和DPPH自由基均具有一定的清除能力,并呈现一定的剂量依赖关系。在同等浓度条件下,发酵36 h大麦仁冻干粉提取液的羟基自由基和DPPH自由基清除能力明显增强,发酵大麦仁(100 mg)提取液的羟基自由基和DPPH自由基清除能力，分别由发酵前的2.08%±1.29%和34.96%±0.97%增加至93.38%±0.88%和80.18%±1.58%,且抗氧化能力呈现出一定的剂量依赖关系。这表明发酵对大麦仁抗氧化能力的提升有着明显的促进作用。研究表明大麦多酚含量较高,主要包括香草酸、香豆酸、阿魏酸、原儿茶酸和芦丁等。这些多酚物质以自由和结合两种形式存在,小分子自由多酚具有较高的抗氧化性,发酵的作用主要体现在改变多酚物质的结构和种类,使结合态多酚化合物变为游离态,从而提高其抗氧化等生物活性[11]。Hole等[20]和姚芳等[11]发现L.plantarum、L.johnsonii和L.reuteri等乳酸菌发酵可以显著增加大麦中游离没食子酸、阿魏酸、咖啡酸和香豆酸的含量,而L.plantarum发酵还可导致大麦中香草酸和对香豆酸含量的显著减少。这可能是因为一些乳酸菌可以通过脱羧和/或还原反应将这些酚类物质转化为其他酚化合物[19]。本研究也采用了植物乳杆菌作为发酵剂,因此,大麦仁中的酚化合物有可能发生了与上述研究相似的转化过程。

图7 发酵前后大麦仁提取液的羟基自由基和DPPH自由清除活性Fig.7 Scavenging rates of dehusked barley before and after fermentation on hydroxyl radical and DPPH radical

3 结论

通过实验得出，米根霉和乳酸菌混合固态发酵大麦仁的最佳工艺条件为浸泡8 h,蒸煮10 min,发酵36 h,接种量0.5%,接种比例10∶3,发酵温度32 ℃。该条件下得到的发酵大麦仁呈淡黄色,有淡淡的酒香味,酸甜适口,软硬适中,感官评定得分为(9.3±0.35)分(满分:10分)。体外抗氧化活性分析表明,发酵可以显著提升大麦仁的抗氧化活性,发酵大麦仁(100 mg)提取液的羟基自由基和DPPH自由基清除能力，分别由发酵前的2.08%± 1.29%和34.96%±0.97%增加至发酵后的93.38%±0.88%和80.18%±1.58%。因此,利用乳酸菌和米根霉混合固态发酵生产大麦仁发酵食品，可以为大麦功能性食品的开发提供新的思路和途径。