TW37对食管癌TE-1细胞迁移的影响

秦甜甜，张雪燕，李蕾蕾，霍峻锋，石晓丽，王希雅，叶小萍，杨程宇，王 淙

郑州大学药物研究院 郑州 450001

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，在世界上最常见的恶性肿瘤中居第8位[1]。食管癌的发病具有明显的地区差异性，如我国在河南等地高发[2]。发生侵袭转移是食管癌患者病情恶化或死亡的原因，亦是困扰临床医生的一大难题[3]。因此，开发抑制食管癌转移的药物对于食管癌的防治具有重要意义。TW37属于基于结构设计开发的一类新型靶向药物。TW37与Bcl-2同源结构域3结合沟相结合，并与促凋亡蛋白(如Bid、Bim和Bad)竞争，阻止它们与Bcl-2的异源二聚化[4]。研究[5-7]表明，TW37具有促进细胞凋亡、抗肿瘤血管生成、抗迁移等作用。本研究观察了TW37对食管癌TE-1细胞迁移的影响，并探讨其可能机制，为食管癌的治疗和药物开发提供新的思路。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂食管癌细胞株TE-1由郑州大学药物研究院保存，TW37购于美国MCE公司。细胞培养基RPMI 1640、标准胎牛血清(以色列BI公司)，胰蛋白酶消化液和BCA定量试剂盒(北京索莱宝公司)，Vimentin、E-Cadherin以及N-Cadherin一抗(美国CST公司)，β-actin和二抗(南京恩京生物公司)，ECL发光液(美国Therom公司)。

1.2细胞培养TE-1细胞用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在CO2恒温加湿培养箱中培养(37 ℃，体积分数5%CO2)。2～3 d传代一次，每2 d更换培养基一次，收集对数生长期的细胞用于后续实验。

1.3细胞增殖能力检测收集TE-1细胞，以4×103个/孔接种于96孔板，放入培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，加入200 μL含TW37的培养基，设置9个浓度梯度，分别为0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、32.00和64.00 μmol/L，每个浓度设3个复孔，并设置阴性对照。24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中继续孵育4 h，弃去培养基，每孔加入150 μL DMSO，置于摇床上使其充分溶解混匀，在酶标仪上测定570 nm处吸光度(A)值。细胞活力=实验孔A值/对照孔A值×100%。计算24、48、72 h的半数抑制浓度(IC50)。

1.4细胞形态学变化观察收集TE-1细胞，以5×105个/孔接种于6孔板，于培养箱中孵育过夜。次日分别加入浓度为0、2、4 μmol/L的TW37，24 h后收集细胞，在倒置显微镜下拍照，记录细胞形态的变化。

1.5细胞迁移能力检测收集TE-1细胞，以3×105个/孔接种于6孔板，于培养箱中孵育过夜。待细胞达到80%的汇合度时，用200 μL的枪头在中间区域划痕，弃去培养基并用PBS洗去划掉的细胞，于倒置显微镜下拍照。配制TW37浓度为0(对照)、2、4 μmol/L的培养基加入细胞中，继续培养24或48 h，拍照记录细胞迁移情况。细胞迁移率=(0 h划痕宽度-24/48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。实验重复3次。

1.6上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)相关蛋白表达的检测收集TE-1细胞，分别用0(对照)、2、4 μmol/L的TW37处理24 h，使用胰蛋白酶消化后，收集细胞，用PBS清洗2遍，加入适量裂解液于冰上裂解30 min，低温高速离心机收集上清液，BCA试剂盒进行蛋白定量。将蛋白样品中加入6×Loading buffer，100 ℃变性10 min。通过SDS-PAGE分离蛋白并转移至硝酸纤维素膜。用TBST(含Tween 20的Tris缓冲盐，pH 7.8)配制50 g/L脱脂牛奶溶液，在室温下封闭2 h后，加一抗(Vimentin抗体按1∶800稀释，E-Cadherin、N-Cadherin抗体均按1∶500稀释)，4 ℃孵育过夜。洗膜后室温下加二抗(按1∶5 000)继续孵育2 h。ECL发光液孵育NC膜，暗室曝光。用Image J软件分析条带灰度值，以目的蛋白和β-actin灰度值的比值为目的蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

1.7统计学处理使用SPSS 17.0处理数据。采用2×3析因设计的方差分析比较不同浓度的TW37作用24、48 h对TE-1细胞迁移率的影响，采用单因素方差分析比较不同浓度的TW37对TE-1细胞EMT相关蛋白表达水平的影响，两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1TW37对TE-1细胞活力的影响TW37对TE-1细胞活力有明显的抑制作用，随TW37作用浓度和时间的增加，TE-1细胞活力呈降低的趋势(图1)。作用24、48、72 h，TW37对TE-1的IC50分别为(9.77±0.99)、(3.47±0.54)和(2.03±0.31) μmol/L。

图1 TW37对TE-1细胞活力的影响

2.2TW37对TE-1细胞形态的影响2、4 μmol/L TW37作用24 h后，食管癌TE-1细胞由梭形变成了卵圆形，并出现了伪足；4 μmol/L TW37处理的TE-1细胞变形更加显著(图2)。

A、B、C：分别为0、2、4 μmol/L TW37组

2.3TW37对TE-1细胞迁移能力的影响2、4 μmol/L的TW37作用于TE-1细胞24 h及48 h后，细胞迁移受抑，4 μmol/L TW37抑制作用更强。结果见表1。

表1 TW37对TE-1细胞迁移率的影响(n=3) %

F浓度=170.260，F时间=63.900，F交互=26.980，P均<0.001

2.4TW37对TE-1细胞EMT相关蛋白表达的影响2、4 μmol/L的TW37作用于TE-1细胞24 h后，间质分子Vimentin的表达量下降，N-Cadherin表达下调，上皮分子E-Cadherin的表达上调，见图3、表2。

1、2、3：分别为0、2、4 μmol/L TW37组

表2 TW37对TE-1细胞EMT相关蛋白表达的影响(n=3) %

*：与0 μmol/L TW37组比较，P<0.05；#：与2 μmol/L TW37组比较，P<0.05

3 讨论

TW37是Bcl-2家族的新型非肽抑制剂，对多种肿瘤均具有抑制作用[8-10]。文献[8]报道，TW37能诱导结直肠癌细胞中的Caspase-3/9激活并诱导细胞凋亡，且能抑制裸鼠HCT-116细胞移植瘤的生长；TW37单用或与顺铂联用均能够抑制多种卵巢癌细胞的增殖并诱导其凋亡[9]；TW37通过诱导细胞凋亡、下调NF-κB下游基因(如MMP-9和VEGF)，从而抑制胰腺癌细胞体外迁移[10]。因此，我们考虑用Bcl-2的抑制剂TW37来抑制食管癌TE-1的迁移，为临床治疗食管癌提供新的策略。结果表明，TW37可以抑制TE-1细胞迁移。

肿瘤细胞侵袭转移能力的变化常常伴随着EMT过程的发生[11-12]。EMT是指具有极性的上皮细胞转换成具有活动能力、能在细胞基质间自由移动的间质细胞的过程。其标志是上皮样细胞极性的丧失及间质样细胞特性的获得，即典型的上皮样细胞标志物(如E-Cadherin等)表达减少，间质样细胞分子标志物(如N-Cadherin)增加[13]。这种表型的转换使肿瘤细胞摆脱细胞间连接，使没有侵袭性的肿瘤细胞获得侵袭能力，促进肿瘤局部浸润和远端转移[14]。

近年来的研究[15-16]表明，抑制细胞程序性死亡的原癌基因Bcl-2也参与EMT过程。An等[15]发现，将Bcl-2表达载体转染到人乳腺上皮细胞MCF10ATG3B后，上皮细胞的标志物E-Cadherin下调，间质标志物E-Cadherin和Vimentin上调，细胞迁移和侵入增加。Bcl-2在鳞状细胞癌细胞中的过度表达通过N-Cadherin/成纤维细胞生长因子受体/细胞外信号调节激酶途径促进癌细胞存活，且诱导了EMT过程[16]。本研究的实验结果显示，Bcl-2抑制剂TW37可以抑制TE-1细胞迁移，并能使TE-1细胞的形态由梭形(活动能力强)变成了紧密连接的卵圆形(活动能力弱)；Western blot实验结果显示，TW37下调间质分子Vimentin、N-Cadherin的表达，上调上皮分子E-Cadherin的表达，提示TW37可能通过抑制EMT进程进而抑制细胞迁移。

综上所述，TW37可抑制食管癌TE-1细胞迁移，其机制可能与抑制TE-1细胞的EMT进程有关，这为临床治疗食管癌提供了新的策略。