靶向SOX4基因的慢病毒感染对骨肉瘤MG63细胞凋亡的影响

孙光雨,李 昊,裴艳涛

1)肥城矿业中心医院骨一科 山东肥城 271608 2)山东大学齐鲁医院脊柱外科 济南 250000 3)山东大学齐鲁医院手足外科 济南250000

骨肉瘤是一种常见的骨恶性肿瘤，在青少年中的发病率较高[1]。探讨骨肉瘤的发生发展机制和寻找有效的治疗靶点对骨肉瘤的治疗与预防、改善患者预后和降低死亡率具有重要意义。SOX家族是一类超基因家族，具有HMG-box保守基序，编码的蛋白能够与DNA结合，在胚胎发育等过程中发挥着重要作用，同时也与多种肿瘤如骨肉瘤的发生关系密切[2-3]。SOX4是SOX家族中经典的转录因子，在多种肿瘤如肺癌中异常高表达，靶向抑制其表达，能够促进癌细胞的凋亡[4]。近年来研究[5-7]指出，SOX4过表达与骨肉瘤预后不良有关，在骨肉瘤细胞生长和凋亡过程中发挥着重要作用。Caspase-3介导的凋亡是骨肉瘤细胞凋亡的重要途径，而SOX4是否通过Caspase-3介导的凋亡途径来发挥调控作用尚不明确。因此，本研究以骨肉瘤MG63细胞为研究对象，用靶向SOX4基因的慢病毒感染MG63细胞，观察细胞凋亡的变化，并从Caspase-3途径探讨机制以期为骨肉瘤的靶向治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1材料人成骨细胞株hFOB1.19和骨肉瘤细胞株MG63购于中科院上海细胞库。慢病毒载体系统和PCR引物购于上海吉凯公司，胰蛋白酶和DMEM培养基购于美国Gibco公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡双染试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、Caspase-3活性检测试剂盒和Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO均购于上海碧云天公司，BCA蛋白检测试剂盒和Trizol试剂购于美国Invitrogen公司，反转录试剂盒购于美国Sigma公司，HRP标记的二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司，GAPDH、SOX4、酶切Caspase-3一抗购于美国Santa Cruz公司，PCR引物购自上海生工生物工程有限公司，PCR仪购于日本TaKaRa公司，流式细胞仪购于美国Thermo公司，CO2培养箱购于美国Shellab公司。

1.2细胞培养取冻存的MG63细胞和hFOB1.19细胞，37 ℃水浴融化，加入DMEM培养基稀释，离心弃上清，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，转至培养瓶中，置于饱和湿度、37 ℃和体积分数5%CO2培养箱内培养，每2 d换液一次，胰蛋白酶消化传代一次。

1.3MG63和hFOB1.19细胞SOX4表达的检测

1.3.1 SOX4 mRNA表达的检测 采用qRT-PCR法。收集MG63和hFOB1.19细胞，以Trizol法提取总RNA，并以Nanodrop进行浓度和纯度的定量。根据反转录试剂盒说明合成cDNA。SOX4上游引物5’-GTGAGCGAGATGATCTCGGG-3’，下游引物5’-CAGGTTGGAGATGCTGGACTC-3’；内参GAPDH上游引物5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。取cDNA 1 μL，上、下游引物各0.4 μL、Power SYBR Green Master Mix 10 μL和ddH2O 8.2 μL配制反应体系。反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算各组细胞中SOX4 mRNA的相对表达量。实验重复3次。

1.3.2 SOX4蛋白表达的检测 采用Western blot法。收集MG63和hFOB1.19细胞，于冰上加细胞裂解液充分反应， 3 000 r/min离心15 min。用BCA蛋白检测试剂盒对上清液进行浓度和纯度的检测。取沸水浴后的50 μg蛋白样品，至120 g/L SDS-PAGE凝胶中电泳。待蛋白分离后，采用湿转法转膜,浸入TBST配制的50 g/L脱脂奶粉中孵育2 h。加入一抗(按1∶500稀释的SOX4),4 ℃下反应24 h。经TBST漂洗(每次5 min,洗涤3次)后，加入HRP标记的二抗(按1∶2 000稀释)，37 ℃下孵育2 h。加ECL，暗室中显影，采用全自动化学发光分析仪进行分析。以目的蛋白与内参条带灰度值的比值作为目的蛋白的表达水平。实验重复3次。

1.4靶向SOX4基因的慢病毒感染对MG63细胞凋亡及相关指标的影响

1.4.1 细胞分组 干扰质粒LV-SOX4-GFP-shRNA(干扰序列为5’-GCGACAAGATCCTTTCATTC-3’)和阴性对照LV-NC-GFP-shRNA质粒(5’-TTCTC CGAACGTGTCACGT-3’)的构建由上海吉凯公司完成。感染前，将3×105个处于对数生长期的MG63细胞接种至25 cm2培养瓶中常规培养，分为4组。阴性组：以LV-NC-GFP-shRNA感染细胞。干扰组：以LV-SOX4-GFP-shRNA感染细胞。干扰+抑制剂组：在LV-SOX4-GFP-shRNA感染细胞前0.5 h，加入浓度为40 μmol/L的Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO。对照组：未感染细胞。感染方法：MG63细胞加入8 mg/L凝胶胺孵育30 min，再加入20 μL慢病毒颗粒溶液培养10 h，更换培养基再培养48 h；按照1∶2比例传代，待细胞贴壁时，加入500 μg/L嘌呤霉素进行药物筛选；扩大耐药细胞株的培养，获得稳定沉默SOX4基因的MG63细胞。采用qRT-PCR和Western blot检测对照组、阴性组和干扰组细胞中SOX4 mRNA和蛋白的表达，以评估感染效果，具体步骤参照1.3.1和1.3.2。

1.4.2 细胞凋亡和线粒体膜电位的流式细胞仪检测 收集4组细胞，分别参照AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒和线粒体膜电位检测试剂盒说明书步骤，采用流式细胞仪检测细胞凋亡及JC-1染色后的荧光强度。线粒体膜电位以红色荧光强度与绿色荧光强度的比值表示。

1.4.3 Caspase-3活性和酶切Caspase-3蛋白检测收集4组细胞，参照Caspase-3活性检测试剂盒说明书的步骤操作，以酶标仪检测Caspase-3活性。参照1.3.2方法检测各组细胞中酶切Caspase-3蛋白的表达情况，其中酶切Caspase-3抗体的稀释度为1∶800。

1.5统计学处理采用SPSS 22.0处理数据。采用两独立样本t检验比较hFOB1.19细胞和MG63细胞中SOX4的表达；采用单因素方差分析比较对照组、阴性组和干扰组细胞SOX4表达的差异，判断感染效果；采用单因素方差分析比较4组细胞凋亡率、线粒体膜电位以及Caspase-3蛋白表达和活性的差异，两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1hFOB1.19细胞和MG63细胞中SOX4表达的比较与hFOB1.19细胞相比，MG63细胞中SOX4的表达水平升高，见图1、表1。

图1 hFOB1.19细胞和MG63细胞中SOX4的表达

细胞nmRNA蛋白hFOB1.1931.00±0.060.36±0.03MG6332.57±0.110.86±0.05t21.703 14.852 P<0.001 <0.001

2.2靶向SOX4基因的慢病毒的沉默效果干扰组MG63细胞中SOX4 mRNA和蛋白的表达低于对照组和阴性组，结果见图2、表2。

图2 慢病毒的沉默效果

组别nmRNA蛋白对照组31.00±0.080.62±0.05阴性组30.96±0.050.53±0.07干扰组30.32±0.03*0.11±0.02*F133.71485.500 P<0.001<0.001

*：与对照组相比，P<0.05

2.3 4组MG63细胞凋亡及线粒体膜电位的比较与对照组相比，干扰组和干扰+抑制剂组细胞的凋亡率升高、线粒体膜电位降低，干扰组细胞的凋亡率高于干扰+抑制剂组，线粒体膜电位低于干扰+抑制剂组。见表3。

表3 4组MG63细胞凋亡率及线粒体膜电位的比较

2.4 4组MG63细胞Caspase-3蛋白表达和活性的比较与对照组相比，干扰组和干扰+抑制剂组细胞Caspase-3活性和蛋白表达水平升高；与干扰组相比，干扰+抑制剂组中Caspase-3活性和蛋白表达降低，见图3、表4。

图3 4组MG63细胞中Caspase-3蛋白的表达

组别n酶切Caspase-3 蛋白Caspase-3活性对照组30.35±0.030.23±0.02阴性组30.33±0.050.20±0.03干扰组30.83±0.05*0.64±0.03*干扰+抑制剂组30.57±0.03*#0.36±0.02*#F96.235 185.962 P<0.001 <0.001

*：与对照组相比，P<0.05；#：与干扰组相比，P<0.05

3 讨论

骨肉瘤是一种常见的恶性程度高和进展快的骨恶性肿瘤，其在青少年中的发病风险明显高于中老年群体，且发病率有上升的趋势；目前，骨肉瘤的治疗手段仍以手术切除为主，但其预后效果和患者5 a内的生存状况并不理想[8-9]。随着科技的发展，基因治疗逐渐成为医学领域抗骨肉瘤研究的热点。SOX4是SOX家族中经典的转录因子，在多种恶性肿瘤中异常高表达，参与肿瘤细胞的增殖、转移和凋亡过程，与患者预后不良关系密切。Dai等[10]发现，SOX4在黑色素瘤中高表达，可通过Akt信号通路影响葡萄糖的消耗和乳酸的生产，从而促进黑色素瘤细胞增殖，同时调控细胞凋亡和细胞周期阻滞。Qian等[11]在卵巢癌组织中也发现SOX4高表达，RNA干扰其表达后，卵巢癌细胞HO-8910和SKOV3的增殖和转移受抑，细胞凋亡增强。除此之外，SOX4还参与癌细胞的耐药机制。如符立平等[12]发现SOX4在顺铂耐药细胞KYSE30/DDP中的表达高于KYSE30细胞，干扰其表达后，细胞对顺铂的敏感性增强。

诱导肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的有效方法之一。然而，细胞凋亡是一个复杂的过程，目前已知的凋亡途径主要包括内质网应激介导的凋亡通路、穿孔素/颗粒酶介导的细胞凋亡通路、死亡受体介导的外源性凋亡通路及细胞线粒体介导的内源性凋亡通路，而后3种途径均是通过相同的凋亡执行信号Caspase-3通路来完成[13]。Caspase-3是机体正常发育过程中细胞凋亡关键酶，其在骨肉瘤的异常表达与骨肉瘤的发生发展关系密切[14]。已有研究[6,15-16]证实下调SOX4表达能够诱导骨肉瘤细胞凋亡。本研究以骨肉瘤MG63细胞为研究对象，用靶向SOX4基因的慢病毒感染MG63细胞，观察其对细胞凋亡的影响。结果发现，沉默SOX4基因后，MG63细胞的凋亡率、Caspase-3活性和蛋白表达均升高，而线粒体膜电位降低，给予Caspase-3抑制剂干预后，这种变化趋势得到部分缓解，说明SOX4诱导骨肉瘤细胞凋亡的机制可能与Caspase-3介导的凋亡途径有关。该研究结果为以SOX4为靶点，靶向治疗骨肉瘤提供了参考。