实验性自身免疫性重症肌无力大鼠多肌群SNX17基因的表达

张艳停，吕 杰，赵 雪，张迎娜，方 华，李倩如，杜 英，张清勇，杨俊红，张运克，高 峰，李 昕

1)郑州大学第二附属医院神经内科 郑州 450014 2)郑州大学医药科学研究院神经免疫学研究室 郑州 450052 3)郑州大学基础医学院免疫学系 郑州 450001 4)郑州大学第二附属医院普胸外科 郑州 450014 5)河南中医药大学第一附属医院脑病科 郑州 450000 6)河南中医药大学康复医学院康复办公室 郑州 450000

重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是一种主要累及神经肌肉接头(neuromuscular junction，NMJ)突触后膜(终板膜)的获得性自身免疫性疾病，其特征为朝轻暮重[1]，人群患病率约50/10万[2]。研究结果[3-4]表明，分拣微管连接蛋白17(sorting nexin 17，SNX17)参与调节多种细胞表面蛋白内吞、胞内分选过程，并通过其FERM-like基元与低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR)、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(low density lipoprotein receptor-related protein 1，LRP1)、P-选择素和载脂蛋白2(the ε2 isoform of ApoE，ApoER2)等多种膜蛋白胞内域NPxY基元结合，促进这些膜蛋白高效率循环再利用到细胞膜[5-6]。LRP4是最近发现的参与NMJ乙酰胆碱受体(acetylcholine receptors，AChR)聚集的关键聚集蛋白受体，与肌肉特异性受体酪氨酸激酶(muscle specific kinase，MuSK)、烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic Acetylcholine receptor，nAChR) 共同组成运动终板膜特有的功能单位(LRP4-MuSK-nAChR Uint，LMA)，在神经肌肉兴奋化学传递中发挥重要作用。课题组前期研究[7]发现MG患者肋间肌肌细胞中SNX17含量明显增高，并与AChR共定位于NMJ处，通过双向免疫共沉淀(Co-IP)及Western blot验证了原核表达的LRP4胞内区蛋白与真核表达的SNX17体外可直接结合，推测LRP4在MG患者NMJ处肌细胞内通过与SNX17结合，逃避溶酶体降解，实现胞内的循环再利用[8]。本实验用人工合成的鼠源性AChR-α亚基97～116肽段建立实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)大鼠模型，采用qRT-PCR、Western blot检测SNX17 mRNA、蛋白的表达情况。

1 材料与方法

1.1材料与试剂健康雌性lewis大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)；鼠源性AChR-α亚基97～116肽段(来自Gene Norway rat)由上海淘普生物科技有限公司合成，序列号为DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI(20aa)；完全福氏佐剂(CFA)、不完全福氏佐剂(IFA)(美国Sigma公司)；qRT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)；小鼠抗大鼠SNX17抗体(美国Santa Cruz公司)，兔抗鼠GAPDH(杭州贤侄生物科技有限公司 )，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠和羊抗兔抗体(北京鼎国生物技术有限责任公司)。

1.2实验分组及EAMG大鼠模型的建立将20只大鼠(6～8周，体重150～160 g)按随机数字法分为正常对照组和实验组，每组各10只。采用人工合成鼠源性AChR-α亚基97～116肽段为免疫原诱导实验组大鼠建立动物模型。初次免疫制成乳剂200 μL(采用CFA)，含鼠源性AChR-α亚基97～116肽段100 μg，在大鼠的背部4点及双足垫注射(背部每点40 μL，足垫每点20 μL)，第2、第3次免疫分别于初次免疫后第30天及第45天同等部位给予同等剂量免疫(采用IFA)。第3次免疫一周后开始评价模型。以Lennon分级评分≥1分[9]，ELISA法测定大鼠血清AChRAb 呈阳性，同时低频(5Hz)重复电刺激后，腓肠肌肌电图在第5次出现衰减幅度大于10%为造模成功标准。正常对照组给予同等剂量的佐剂与PBS。本实验内容及过程已通过郑州大学生命科学伦理审查委员会的审核。

1.3 2组大鼠肌细胞中SNX17、AChRβ亚型mRNA含量的qRT-PCR法检测体积分数5%水合氯醛麻醉大鼠，取出各肌群肌肉组织，预冷PBS洗涤2 次，每组肌群各称取40 mg肌肉液氮下匀浆，用Trizol一步法提取RNA，按反转录试剂盒说明书将RNA反转成cDNA。用Premier 5.0设计引物，SNX17上游引物序列5’-GACGACGATGTCATG GAGAA-3’，下游引物序列5’-AGATTTGAGCT GTCGGTGCT-3’；nAChR上游引物序列5’-AGCCT GAACGAGAAGGATGA-3’，下游引物序列5’-TGA CACGGAGAGACTCGATG-3’；内参β-actin上游引物序列5’-TGTCACCAACTGGGACGATA-3’，下游引物序列5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’；均由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成。qRT-PCR采用20 μL的反应体系，荧光预变性反应条件为95 ℃ 30 s；PCR反应条件：95 ℃ 5 s、55 ℃ 30 s，45个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.4 2组大鼠肌细胞中SNX17蛋白含量的Westernblot检测取上述肌肉组织，分别加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min离心5 min后取上清，BCA法测蛋白浓度，每孔加5 μL样品，以GAPDH作为内参，小鼠抗大鼠SNX17抗体(按1∶500稀释)及兔抗鼠GAPDH抗体(按1∶1 000稀释)作为一抗4 ℃孵育过夜，37 ℃复温30 min，加HRP标记的羊抗小鼠抗体(按1∶10 000稀释)和 HRP标记的羊抗兔抗体(按1∶10 000稀释)37 ℃孵育1 h，曝光，采用图像分析软件Quantity One测定各条带灰度值，以目的条带和内参条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.5统计学处理采用SPSS 17.0对数据进行分析，应用两独立样本的t检验比较2组大鼠不同肌群中SNX17、nAChR mRNA和SNX17蛋白含量的差异，相关性分析应用Pearson相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1EAMG实验大鼠模型的建立实验组多只大鼠在首次免疫第7周后出现活动减少，撕咬无力，反应迟钝，容易疲劳等症状，最终8只建模成功。

2.2 2组大鼠不同肌群中SNX17和nAChRmRNA含量比较见表1和2。与正常对照组相比，EAMG组大鼠心肌、肋间肌中SNX17 mRNA的表达升高(P<0.05)，膈肌中SNX17 mRNA的表达降低(P<0.05)；胸锁乳突肌、腓肠肌和眼肌中nAChR mRNA的表达降低(P<0.05)，心肌中nAChR mRNA的表达升高(P<0.05)。

2.3 2组大鼠不同肌群中SNX17蛋白含量比较见表3。与正常对照组相比，EAMG组大鼠咬肌、心肌、腓肠肌中SNX17蛋白含量表达增加，而在胸锁乳突肌、膈肌表达降低(P<0.05)。

2.4EAMG组大鼠不同肌群中SNX17与nAChRmRNA表达水平的相关性分析Pearson相关分析显示，EAMG组腓肠肌中SNX17 mRNA与nAchR mRNA的表达呈负相关(r=-0.773，P=0.035)，在心肌中两者间的表达呈正相关(r=0.947，P=0.012) ；其余肌群中二者的表达无相关性。

表1 2组大鼠不同肌群中SNX17 mRNA含量比较

表2 2组大鼠不同肌群中nAChR mRNA含量比较

表3 2组大鼠不同肌群中SNX17 蛋白含量比较

3 讨论

SNXs是涉及细胞内蛋白质运输的蛋白质家族。该家族的特征是存在phox(PX)同源结构域，并已被证明能够与磷脂酰肌醇磷酸酯(PtdInsP)结合。SNX17是SNXs家族中的成员，是首先被确定为细胞黏附蛋白——P-选择蛋白的细胞质尾部的结合伴侣。与许多SNX类似，SNX17定位于早期内体。已有研究[3-4]表明SNX17介导多种细胞表面蛋白内化、再循环及降解，包括P-选择蛋白、淀粉样蛋白前体蛋白、整联蛋白α1、 LDLR、LRP1、ApoER2和FEEL1等。SNX17还含有4.1/ezrin/radixin/moesin(FERM)结构域，可与P-选择蛋白相互作用，一方面加速其胞膜内吞， 另一方面又阻止其向溶酶体转运，从而减缓其降解[10]。

MG是T 细胞依赖的、抗体介导的自身免疫性疾病，根据胸腺病理分型可分为胸腺增生和胸腺瘤，其病理特征为突触后膜皱褶减少、缩短、简单化、AChR数量减少。有研究[11-12]报道MG患者治疗前T 细胞亚群紊乱明显者，即CD8+百分比下降、CD4+/CD8+升高明显者，经糖皮质激素及胸腺扩大切除术治疗后效果较好，且胸腺切除术后患者的甲状腺功能紊乱得到纠正。还有研究[13]表明MG主要与AChR抗体、MuSK抗体和LRP4抗体3种自身抗体有关；生理情况下，LRP4结合聚集蛋白，促进MuSK发生酪氨酸磷酸化，诱导nAChR聚集于终板膜，使神经冲动正常传导[14-15]。

EAMG模型可经乙酰胆碱受体主动免疫注射[16]或被动接种抗乙酰胆碱受体抗体诱导而制得[17-18]。作者采用主动免疫法成功构建了EAMG模型，为研究MG的发病机制、血清学诊断及免疫治疗等开辟了有效的途径。本研究结果显示，与正常对照组相比，EAMG组大鼠心肌SNX17 mRNA和蛋白的表达升高，膈肌中SNX17 mRNA和蛋白的表达降低，该结果解释了MG患者的部分临床特点，即常常是某一组或几组肌群受累，单纯累及眼肌的发病率最高，也可累及咬肌、四肢肌等肌群；而心肌重要脏器肌肉组织可能通过机体代偿机制调节，很少被累及。EAMG组腓肠肌中SNX17 mRNA与nAchR mRNA的表达呈负相关，而在心肌中两者间的表达呈正相关，提示SNX17可能是NMJ处的关键蛋白。但鉴于研究的样本量较少，需扩大样本量进一步明确两者间的关系。

综上所述，SNX17和nAChR在EAMG不同肌群中的表达水平不同，且二者在心肌的表达呈正相关，提示SNX17对预防自身抗体引发MS危象和心脏骤停具有重要作用；而参与呼吸运动的膈肌上述分子的表达较低，其原因还需要进一步研究。