miR-210基因表达和多态性与肺癌易感性的关系

徐勇超，丁明翠，冯晓蕾，段晓冉，王彭彭，刘 斌，张 辉，魏 婉，王 威

郑州大学公共卫生学院劳动卫生与职业病学教研室 郑州 450001

目前，肺癌的发病率和病死率均居于我国恶性肿瘤之首[1-2]。早期肺癌患者无特异的临床症状，且缺乏有效的诊断手段，约75%的肺癌患者在确诊时已是晚期，而晚期肺癌患者的5 a生存率仅为15%左右[3]。因此，需要开展肺癌早期诊断生物标志物研究。成熟的微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度为20～24个核苷酸的内源性非编码RNA。miRNA能在转录后水平调节一系列肿瘤相关基因的表达，进一步影响细胞周期调控，从而影响肿瘤的发生和发展[4]。miR-210的编码基因位于染色体11p15.5，研究[5]发现miR-210可以调节细胞的增殖、分化，促进血管生成、免疫调节和心肌能量代谢等，在各种生物过程中均发挥着重要的作用。研究[6-7]表明，miR-210在肺癌组织中的表达水平高于正常组织，可能与肺癌发病相关；非小细胞肺癌患者血浆miR-210表达水平高于正常对照组，说明血浆miR-210可能是非小细胞肺癌早期诊断潜在的血液生物标志物。该研究探讨了人外周血血浆中miR-210基因表达及其多态性与肺癌易感性的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象肺癌组来源于2016年6月至2017年2月在郑州大学第一附属医院、河南省肿瘤医院、河南省胸科医院就诊，且经过病理组织学确诊的137例原发性肺癌患者；年龄29～87岁；其中小细胞癌17例，鳞癌35例，腺癌61例，大细胞癌2例，其他类型22例。对照组为2016年7月在河南省某医院体检健康的141人，年龄36～76岁。

1.2一般资料的收集研究对象知情同意后，采用设计好的调查问卷通过面对面访谈的方式进行调查。调查问卷的内容主要包括流行病学资料(年龄、性别、吸烟、饮酒、个人疾病史、癌症家族史等)、肺癌患者的临床临床症状资料(咯血、发热、胸闷、胸痛、痰中带血、乏力咳嗽)和临床病理特征资料(组织学类型、TNM分期、淋巴结转移、远端转移)。吸烟的定义为每天1支或以上，连续吸烟6个月或以上。饮酒的定义为每周至少饮酒1次，每次折合成纯乙醇20 g以上。

1.3血浆miR-210表达水平的检测严格按照miRcute miRNA提取分离试剂盒(DP501型，北京天根生化科技有限公司)操作说明进行血浆中miRNAs富集部分的提取；采用qRT-PCR技术(7500 Fast Real-time PCR仪,美国ABI公司)检测血浆中miR-210表达水平，采用DYY-8C型电泳仪(北京六一仪器厂)对扩增产物进行定性检测。采用无人体内源性表达的线虫的某miRNA(CR100，北京天根生化科技有限公司)为外参。miRNA表达水平采用2-ΔΔCt计算[8]：ΔCt=Ct目标-Ct外参，ΔΔCt=ΔCt目标-ΔCt对照平均。

1.4miR-210基因多态性检测结合文献资料选择miR-210基因的SNPs，最终纳入rs11246190、rs12364149、rs7395206和rs7395908，这4个SNPs的基本信息及引物序列见表1。严格按照全基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物科技有限公司)说明进行外周血白细胞基因组DNA的提取。DNA样本送至北京博淼生物科技有限公司，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(美国Sequenom公司MassArray系统)检测基因型。

表1 4个SNPs基本信息及其引物序列

1.5统计学处理采用SPSS 21.0对数据进行分析。2组性别、年龄构成及吸烟饮酒状况的比较采用χ2检验，血浆miR-210表达水平的比较采用秩和检验；采用Hardy-Weinberg平衡分析对照人群基因型频率分布情况；通过建立logistic回归模型分析肺癌患病的影响因素。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1两组一般情况的比较两组年龄、性别构成及吸烟、饮酒情况差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 2组研究对象的一般资料的比较 例

2.2两组血浆miR-210表达水平的比较肺癌组与对照组miR-210表达水平分别为1.18(0.58,3.08)和0.71(0.39,1.26)，差异有统计学意义(Z=4.421，P<0.001)。

2.3两组miR-210的4个SNPs位点的多态性分布及与肺癌的关系在对照组中，除rs11246190外，其他3个位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，说明所选样本具有群体代表性。部分DNA样本无法扩增，导致样本量有减少。因rs11246190位点GG型在肺癌组中只检测到1例，在对照组中只检测到2例，因此将GG和AG型合并分析；rs12364149位点GG型在对照组中只检测到4例，因此将CG和GG型合并分析。肺癌组和对照组4个位点的多态性分布见表3。结果显示，两组rs11246190基因型频率差异有统计学意义(P<0.05)，AA型携带者患肺癌的风险显著增加(OR=1.967，95%CI=1.124～3.443)。两组其他3个位点的基因型频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4肺癌患病影响因素分析以组别为因变量(对照为0，肺癌为1)，以年龄(<60岁=1，≥60岁=2)、性别(男=1，女=2)、吸烟(否=0，是=1)、饮酒(否=0，是=1)、miR-210表达水平(等级资料)、rs7395206基因型(CC=1，CT=2，TT=3)、rs12364149基因型(CC=1，CG+GG=2)、rs11246190基因型(AG+GG=1，AA=2)为自变量，进行logistic回归分析，结果(表4)显示，吸烟、miR-210表达水平升高、rs11246190 AA基因型携带者肺癌患病风险升高。

表3 2组miR-210基因型分布 例(%)

表4 Logistic回归分析

3 讨论

研究[9-10]发现miR-210在肺癌患者中表达水平高于正常对照，且与淋巴结转移、不良预后、肺癌分期有关。Pak等[11]研究发现，肺癌晚期A549细胞中miR-210存在高表达，且miR-210的表达水平与肿瘤大小、TNM分期呈正相关。Daugaard等[12]发现，淋巴结转移阳性的肺腺癌患者血浆中miR-210表达水平高于淋巴结转移阴性者。本研究发现肺癌患者血浆miR-210的表达水平高于正常对照，提示miR-210表达与肺癌发生有关。

miRNA的SNPs可以分为两大类[13]：一类位于初始转录本和前体miRNA，这类SNPs通过影响miRNA的生物学功能，从而影响成熟miRNA的表达水平。一类SNPs可以通过影响miRNA识别靶mRNA的能力，从而影响miRNA的表达水平及其生物学功能。越来越多的研究[14-15]表明，肺癌的发生发展可能与miRNA上的SNPs位点有关，但绝大多数都是关于miR-196和miR-146与肺癌关系的报道，目前还未见miR-210多态性与肺癌易感性的相关报道。因此，该研究对miR-210基因4个SNPs与肺癌易感性的关系进行了探讨。结果显示，rs11246190在肺癌组和对照组间的基因型频率分布有差异，rs11246190 AA基因型携带者患肺癌的风险增加。

大量的流行病学研究[16]显示，吸烟是肺癌发生发展的重要危险因素，且两者之间存在一定的剂量-效应关系。有研究[17]发现，香烟烟雾暴露可以导致大鼠肺组织中miRNAs表达异常，从而导致细胞周期调控发生紊乱；且超过一半的编码miRNA的基因位于基因组的脆性位点或区域，miRNAs的遗传改变可能促进靶基因的表达改变，加速细胞的恶性转化[18]。Logistic回归结果显示，吸烟人群患肺癌的风险显著升高(OR=2.495)，与上述研究结果一致，提示吸烟是肺癌的易感因素；血浆miR-210表达水平升高者患肺癌风险增加(OR=1.123)，且miR-210 rs11246190位点AA基因型携带者患肺癌的风险为AG+GG基因型的2.479倍，提示血浆miR-210高表达和rs11246190位点AA基因型与肺癌易感性有关系。

综上所述，血浆miR-210表达水平以及miR-210基因 rs11246190多态可能与肺癌的发病有关，但miR-210表达和基因多态性与肺癌发病机制的关系还需进一步探讨。