miR-101对结直肠癌细胞增殖、凋亡及KIF14蛋白表达的影响

刘继攀，孙 伟，赵学荣，李炳茂，王成君

衡水市哈励逊国际和平医院(衡水市人民医院)普外二科 河北衡水053000

microRNA是广泛存在于真核生物体中的微小RNA，具有高度保守性，不含开放阅读框，可调控靶基因的表达[1]。miR-101-3p(miR-101)是一种与肿瘤发生有关的miRNA，其可以调控原癌基因的表达，影响多种肿瘤的发生和发展[2-3]。驱动蛋白家族蛋白14(kinesin family member 14,KIF14)是一类较为保守的微管依赖型马达蛋白，具有ATP酶活性，参与染色体分离、小泡运输、胞质分裂等生命活动；其在宫颈癌、视网膜母细胞瘤等组织中表达上调，并且参与调控肿瘤细胞的生长、凋亡过程[4-5]。我们根据靶基因预测库(TargetScan、The miRBase、PicTar)预测,miR-101能够与KIF14 的3’UTR结合，提示KIF14 有可能是miR-101的靶基因。因此，我们检测了结直肠癌组织和细胞中miR-101和KIF14蛋白的表达，同时观察上调miR-101表达对结直肠癌细胞增殖、凋亡及KIF14 蛋白表达的影响，探讨miR-101与结直肠癌的关系。

1 材料与方法

1.1材料选取衡水市人民医院2015年4月至2017年3月收治的50例结直肠癌患者，收集癌组织和距离癌组织5 cm的正常组织，标本保存在液氮中；患者男33例，女17例，年龄41～73岁。正常结直肠细胞FHC和结直肠癌细胞HCT116、HT29、LoVo、SW620、SW480购自美国ATCC。miR-101 模拟物、模拟物阴性对照购自上海吉玛制药技术有限公司；突变型和野生型KIF14荧光素酶报告载体(pMIR-LUC-3’-UTR-KIF14-MUT和pMIR-LUC-3’-UTR- KIF14-WT)由广州辉骏生物科技有限公司构建；RNA提取试剂盒购自美国Thermo公司；KIF14抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；PCR所用试剂均购自美国ABI公司，引物由金唯智生物公司合成；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；MTT购自美国Sigma公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2miR-101和KIF14靶向关系的鉴定用脂质体转染法将pMIR-LUC-3’-UTR-KIF14-MUT、pMIR-LUC-3’-UTR-KIF14-WT分别与miR-101 模拟物、阴性对照共转染至HT29细胞中，48 h后，用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.3结直肠癌组织及细胞中miR-101和KIF14蛋白表达的检测

1.3.1 miR-101的检测 用Trizol试剂提取结直肠癌和癌旁正常组织的总RNA，提取FHC和HCT116、HT29、LoVo、SW620、SW480细胞(1×107个)的总RNA，用反转录试剂盒合成cDNA 。以cDNA为模板进行PCR。miR-101 引物F： 5’-GCATG CTCGAGCGTTCTTGGTCCTGTCCCTT-3’，R：5’-TAAGCGGCCGCACCCGTGACACTTTCATTCC-3’。内参U6引物F： 5’-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3’，R：5’-ATGGAACGCTTCACGAATTTG-3’。PCR反应条件：95 ℃15 s，60 ℃1 min，72 ℃30 s，共计40个循环。以2-ΔΔCt法计算目的基因表达水平。

1.3.2 KIF14蛋白的检测 提取结直肠癌组织和癌旁正常组织总蛋白，提取FHC和HCT116、HT29、LoVo、SW620、SW480细胞的总蛋白。蛋白样品在上样前与Loading Buffer混合煮沸5 min，每孔上样

30 μg。配制100 g/L的下层胶和50 g/L的上层胶。上层胶电压80 V，下层胶电压120 V，电泳时间2 h。在200 mA电流条件下将蛋白转移到PVDF膜上，用50 g/L牛血清白蛋白室温环境中孵育1 h，依次加KIF14一抗、HRP二抗反应，ECL发光，用Labwork对蛋白条带进行灰度分析。以β-actin作为内参。以目的蛋白与内参条带灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。

1.4上调miR-101表达后结直肠癌细胞HT29细胞生长情况及KIF14蛋白的表达

1.4.1 实验分组 将miR-101 模拟物和阴性对照分别转染至HT29细胞中(miR-101组和阴性对照组)，操作参照Lipofectamine2000说明。以未转染细胞为正常对照组。

1.4.2 细胞增殖测定 将3组细胞接种于96孔板，每孔3 000个细胞，每组3个复孔。培养24、48、72、96 h后，每孔添加10 μL的MTT溶液孵育4 h，然后添加二甲基亚砜溶液孵育10 min。设置空白调零孔，酶标仪检测490 nm处的光密度(OD)值。

1.4.3 细胞凋亡率测定 3组细胞培养48 h以后，用PBS洗涤，调细胞密度为106个/mL。取1 mL细胞悬液，1 000g离心10 min，取沉淀，添加300 μL的Binding Buffer混合，然后添加PI和Annexin V-FITC，上流式细胞仪检测凋亡率。

1.4.4 KIF14蛋白的表达 检测方法同1.3.2。

1.5统计学处理采用SPSS 21.0分析数据。结直肠癌及正常组织中miR-101 和KIF14蛋白表达水平的比较采用配对t检验，6种细胞中miR-101 和KIF14蛋白表达水平的比较、3组HT29细胞OD、凋亡率和KIF14蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1miR-101与KIF14靶向关系的鉴定miR-101与KIF14的3’UTR结合位点预测结果见图1。双荧光素酶实验结果见表1。共转染miR-101 模拟物和野生型KIF14荧光素酶报告载体后HT29细胞荧光素酶活性降低。

图1 miR-101与KIF14的3’UTR结合位点预测

组别野生型突变型阴性对照1.00±0.111.03±0.18miR-1010.48±0.06*0.96±0.16t7.190 0.503P<0.001 0.641

*：与阴性对照组比较，P<0.05

2.2结直肠癌组织及细胞中miR-101和KIF14的表达见图2和表2、3。结直肠癌组织中miR-101阳性率达71.25%。结直肠癌组织和结直肠癌细胞中miR-101表达下调，KIF14蛋白表达上调。选用HT29细胞做后续实验。

图2 KIF14在结直肠癌组织及细胞中的表达

组别miR-101KIF14蛋白正常组织0.73±0.090.32±0.11结直肠癌组织0.34±0.13*0.85±0.24*t17.4413.39P<0.001<0.001

表3 正常结直肠细胞和结直肠癌细胞中miR-101和KIF14蛋白的表达(n=3)

*：与FHC比较，P<0.05

2.3上调miR-101表达对HT29细胞增殖、凋亡和KIF14蛋白表达的影响各指标检测结果见表4。上调miR-101表达后HT29细胞增殖活性下降，细胞凋亡率升高,KIF14蛋白表达水平下降。

表4 转染miR-101后HT29细胞增殖情况、凋亡率和KIF14蛋白的表达(n=3)

*：与两个对照组比较，P<0.05

3 讨论

miRNA通过与靶基因的3’UTR结合，从而影响基因的转录和蛋白表达。一个miRNA可能靶向调控多个靶基因，发挥多种生物学作用[6-7]。目前发现miR-101可以调控的靶基因有EZH2、COX-2、FOS、Mcl-1等[2,8]。miR-101在不同组织器官中通过调控不同的靶基因发挥生物学功能[9]。研究[10-13]表明，miR-101水平越低，肺癌恶性程度越高；miR-101在肺癌、骨肉瘤等肿瘤组织中表达下调，上调其表达可以抑制肿瘤细胞的生长。miR-101对子宫内膜癌、膀胱癌等的抗肿瘤作用也已被证实[14-15]。本实验结果显示，miR-101在结直肠癌组织及细胞中的表达水平均降低，上调miR-101表达可以抑制结直肠癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡，说明miR-101在结直肠癌中发挥类似抑癌基因的作用。

KIF14基因定位于1q32.1，其编码的蛋白质含有1 648个氨基酸，属于N型驱动蛋白，含有一个驱动蛋白、一个N末端延伸、一个驱动蛋白马达结构域；其在正常人类胸腺组织中低表达，参与调控细胞生长过程[16]。研究[17-19]发现，KIF14可以作为一种癌基因，促进诸如视网膜母细胞瘤、卵巢癌、肝癌等肿瘤的发生。本实验结果表明，KIF14在结直肠癌组织和细胞中表达上调，与上述研究结果一致。

本实验结果还表明，miR-101能够与KIF14的3’UTR结合，靶向负调控KIF14的表达；miR-101可能通过靶向调节KIF14蛋白的表达，参与调控结直肠癌细胞的增殖和凋亡。

总之，miR-101通过靶向调控KIF14，抑制结直肠癌细胞的生长并诱导凋亡，这为研究结直肠癌分子发生机制提供了思路。