C3肾小球病患者血清MASP2、MASP3水平检测

刘冬雨，刘 璐，张 颖，邢国兰

郑州大学第一附属医院肾脏内科 郑州 450052

C3肾小球病(C3 glomerulopathy,C3G)是一个总括性概念，也是新近提出的一种疾病分类，它包括几种相对罕见的肾小球肾炎，如致密物沉积病和C3肾小球肾炎,这些疾病均以单纯补体C3沉积于肾小球为重要的组织特征。补体有三大激活途径：经典途径、甘露糖结合凝集素(mannan-binding lectin，MBL)途径、旁路途径，其中旁路途径目前被认为与C3G发病机制关系最密切。在过去的10 a里，补体旁路途径的异常调控已作为本病发生的常见病因之一被多次阐述[1]，而其他两种补体活化途径是否参与C3G的发生与发展却少见报道。MBL途径由MBL识别病原体甘露糖残基启动[2]，通过激活甘露糖结合丝氨酸蛋白酶-2(mannan-binding lectin serine peotease-2，MASP2)，进一步裂解C4和C2，形成MBL途径C3转化酶[3]。C3转化酶裂解C3为C3a和C3b，进一步形成C5转化酶，最终形成膜攻击复合物，导致细胞溶解死亡。有研究[4]发现在C3肾小球肾炎患者的血浆中补体片段C4a的水平高于健康对照组，而C4a则是由补体C4经MASP2裂解而产生，表明MBL途径的活化很可能在一定程度上参与C3G的发生。MASP3是近年新发现的MASP家族成员。有研究[5]显示MAPS3参与补体旁路途径活化关键酶D因子的活化，从而通过旁路途径参与C3G的发生，是连接MBL途径和旁路途径的桥梁。本研究旨在通过分析血清MASP2、MASP3水平与C3G患者临床表现及病理改变的关系，探讨MBL途径在C3G发病中的作用。

1 对象与方法

1.1研究对象选取2012年1月至2017年6月在郑州大学第一附属医院肾脏内科行肾活检及外院会诊，并经临床和病理诊断为C3G的患者15例(C3G组)。诊断标准[6]:①光镜下可见肾小球系膜增生、膜增生、毛细血管内皮增生或新月体。②免疫荧光显示显著C3沉积，C3含量至少比其他免疫球蛋白和补体成分高2个级别，可伴少量免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)。③电镜下多数病例有电子致密物沉积于肾小球基底膜，也可沉积于系膜区、毛细血管袢和肾小管基膜等。排除感染后肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、冷球蛋白血症、淀粉样变性、慢性乙型或丙型肝炎病毒感染、甲状腺相关疾病及恶性肿瘤等。C3G组中男11例，女4例；14例为C3肾小球肾炎，1例为致密物沉积病。对照组为与C3G患者年龄、性别相匹配的健康志愿者10名。该研究经医院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.2一般及临床资料收集收集肾活检时的临床资料，包括性别、年龄、BMI、血压、血脂、血糖、24 h尿蛋白定量、血尿、肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)等指标。

1.3血清MASP2、MASP3水平测定收集患者肾活检当天的EDTA抗凝分离血清，-80 ℃保存。使用美国BD公司商品化试剂盒，以ELISA法测定血清MASP2、MASP3水平。

1.4肾活检病理检查①免疫荧光检查：观察免疫球蛋白IgG、IgM、IgA及补体C3、C1q有无沉积及其沉积的程度，以-、±、+～表示。②光镜检查：常规制备石蜡切片进行HE、PAS、Masson和PASM染色，观察肾小球形态、细胞增生程度，是否有球性或局灶节段性硬化及坏死，基底膜是否增厚，及肾小管间质、小动脉病变的程度。③电镜检查:观察肾小球、肾小管及鲍曼囊有无电子致密物沉积及沉积的部位、程度。

1.5统计学处理采用SPSS 21.0处理数据。采用两独立样本t检验比较C3G组和对照组各指标的差异以及不同病理改变的C3G患者血清MASP2、MASP3水平的差异。采用Pearson相关分析C3G患者血清MASP2、MASP3与重要临床指标的相关性。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组一般及临床资料的比较与对照组相比，C3G组血清C3水平、24 h尿蛋白定量、尿RBC、eGFR差异均具有统计学意义，余指标差异无统计学意义。见表1。

2.2 2组血清MASP2、MASP3水平比较C3G组血清MASP2、MASP3水平均高于对照组，见表2。

2.3C3G患者血清MASP2、MASP3与重要临床指标的相关性血清MASP2、MASP3水平与eGFR及血清C3水平均无关，血清MASP3水平与24 h尿蛋白定量呈正相关。见表3。

2.4不同病理改变的C3G患者血清MASP2、MASP3水平比较C3荧光强度低的C3G患者血清MASP2水平高于荧光强度高者，无基底膜内电子致密物沉积的C3G患者血清MASP2水平高于有基底膜内沉积者，见表4、5。

表1 2组一般及临床资料的比较

1 mmHg=0.133 kPa

表2 2组血清MASP2、MASP3水平比较 μg/L

表3 C3G患者血清MASP2、MASP3水平与临床指标相关性分析 r(P)

表4 C3荧光强度不同情况下血清MASP2、MASP3比较 μg/L

表5 有无电子致密物基底膜内沉积时血清MASP2、MASP3比较 μg/L

3 讨论

C3G是罕见的肾小球疾病之一，其发病机制一直是国内外专家探索的热点。众所周知，补体有三大激活途径：经典途径、MBL途径、旁路途径，其中旁路途径目前被认为是与C3G发病机制关系最密切的途径，主要是考虑旁路途径中补体C3自主活化而形成的正反馈过程参与了C3G的发生[7]。有研究[4]发现在C3肾小球肾炎患者血浆中补体片段C4a的水平高于健康对照组，而C4a则是由补体C4经MASP2裂解而产生，表明MBL途径的活化很可能在一定程度上参与C3G的发生。

MBL由肝细胞合成和分泌，是急性期蛋白的一种，可直接识别细胞表面的甘露糖，进而可依次活化MASP1、MASP2、C4、C2、C3，形成一系列酶促反应，从而特异性识别病原微生物，利用补体活化来消灭病原微生物。亦有研究[2]表明，MBL通过与细胞表面的碳水化合物相结合激活MASP1、MASP2、MASP3，从而特异性识别病原微生物，其中MASP2则接着裂解C2和C4，从而激活补体的级联反应。本研究发现，与对照相比，C3G患者血清MASP2和MASP3水平升高。高水平的MASP2被MBL激活后形成大量的MBL-MASP复合物，从而加强了C4的裂解过程，产生更多的C4b和C4a，进一步形成C3转化酶(C4bC2a)，再通过把C3水解为C3a及C3b，激活补体级联反应，最终进入终末通路，在免疫过程中发挥重要作用。这种突出的改变使肾脏出现大量的C3沉积，同时循环中的C3浓度也会因消耗而下降，余下的裂解片段C4a在循环中的水平也会相应处于高水平状态，这与之前报道显示C3肾小球肾炎患者血清C4a浓度高于正常人相一致，这一系列过程提示C3G肾病的发生存在MBL途径的参与。对于MASP3的活化机制目前尚未研究清楚，但曾有研究[5]显示血清MASP3可能是补体D因子的独特激活因子，而D因子作为补体旁路途径的关键酶，可以裂解B因子，形成旁路途径中的C3转化酶C3H20-Bb，从而使其过度活化，C3被裂解为C3a和C3b，C3bBb再反过来促进C3分解，由此形成正反馈，最终造成对肾脏的损伤。因此我们推断MASP3的主要作用是将补体旁路途径与MBL途径联系起来，利用补体途径的过度激活，进而发挥重要的免疫作用。另外，我们还发现，虽然MASP3相对来说没有MASP2的作用更明确，但血清MASP3水平与24 h尿蛋白定量呈正相关，提示MBL途径与C3G活动程度可能存在密切联系。

此外，我们还发现C3荧光强度强或有基底膜内沉积的C3G患者血清MASP2水平较低，这一结果和之前ELISA的结果C3G患者血清MASP2水平升高矛盾，推测可能与本研究样本量偏小有关，也或许是由于MBL途径异常激活过程中，MASP2活化裂解C4能力增强，因MASP2进一步的消耗增多而导致最终血清MASP2水平下降，从而造成病理改变程度加重反而出现低水平的MASP2，其具体作用机制有待以后更深入的研究。

总之，本研究发现MBL途径很可能参与C3G的发生，其中MASP3与24 h尿蛋白定量呈正相关，提示MASP3可能在C3G的病情评估及预后判断中具有潜在价值；另外，MASP2与C3荧光强度、基底膜内电子致密物沉积之间的关系为以后对该病免疫病理方面的深入探索提供了线索。但因该病发病率较低，样本量较少，使研究结果具有一定的局限性，以后拟开展更大样本的研究来进一步验证本研究结果。另外，目前补体抑制剂已经广泛应用于临床[8]，如采用竞争性抑制MBL与MASP之间结合的方式阻断MBL途径的补体活化，有可能减轻或阻断C3G的慢性化发展，开创C3G生物制剂的新领域，改善C3G患者的预后。

致谢：感谢权松霞老师在工作中给予的支持和帮助！