小鼠指甲再生模型建立方法的探索

张新艳, 关玉婷, 李大力

(1. 复旦大学附属妇产科医院研究所, 上海 200011;2. 华东师范大学生命科学学院, 上海 200241)

指甲是皮肤的附属品，具有保护手指末端皮肤, 加强手指运动力量以及维持手指精密感觉功能等作用[1,2]。因此，指甲损伤后的修复十分重要。哺乳动物的指甲主要由四部分组成: 甲板, 甲床, 甲襞以及指甲基质[3]。位于甲床根部区域的指甲干细胞控制着指甲和指头的再生，然而这种能力是非常有限的: 如果指头在超过指甲的地方被截掉(也就是干细胞区被破坏)是不会再生的。2013年, Takeo等[4]发现了位于指甲干细胞区域远端的指甲祖细胞在一个依赖于 Wnt 信号作用的过程中分化成指甲。目前，在指甲干细胞方面的研究报道比较少，而国内对于该领域的研究基础更差。本研究在前人研究基础上对指甲再生模型进行了优化，旨在建立一套指甲干细胞研究模型，形成系统的指甲再生研究方法，为研究Wnt信号通路相关基因在指甲再生过程中的功能提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级8周龄C57BL/6的小鼠雌雄各5只，体质量约25 g左右，华东师范大学实验动物中心提供[SCXK(沪)2016-0004]，饲养于屏障设施[SYXK(沪)2015-0011]，动物实验符合华东师范大学动物伦理委员会的规定并被授权。

1.2 试剂、 仪器设备

质量分数5%的水合氯醛、质量分数10%的乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙液均购自美国Sigma公司;质量分数4%多聚甲醛(PFA)购自上海润捷化学有限公司; 各浓度梯度乙醇购自上海凌峰化学试剂有限公司; 尼康显微镜SMZ745购自日本Nikon公司; 冰冻切片机、石蜡包埋机和组织脱水一体机均购自德国Leica公司; 正置显微镜购自日本Olympus公司。

1.3 小鼠指甲再生模型的建立

取8周龄C57BL/6小鼠雌雄各5只，每只给予5%水合氯醛0.16 mL进行麻醉，小鼠置于37℃加热平板上维持体温。在显微镜下逐一截取实验小鼠左后肢中间的三个指甲进行取材，右后肢作为对照，截取位置如图1A中黑实线所示，与肉眼可见部分的指甲根部呈约15℃角，使截取位置恰在甲床的Wnt信号激活区域[4](图1A 右红色区域)，同时不伤及甲床的干细胞区[4](图1A 右绿色区域)。用酒精棉球轻柔按压指甲伤口15 s止血。3周后，截取实验小鼠双后肢中间的三个脚趾进行取材。模型建立时间轴如图1B所示。

1.4 模型数据的采集

造模3周后取材时，在显微镜下调好标尺，分别测量实验小鼠正常指甲和再生指甲的长度，测量位置如图2A和2B中黑实线所示，记录指尖最顶端与肉眼可见部分的指甲根部的距离。

1.5 石蜡切片的制作及染色

图 1 小鼠指甲再生模型建立示意图

图 2 小鼠指甲电子显微镜下再生数据采集

将截下的小鼠脚趾放入盛有10% EDTA脱钙液的1.5 mL EP管中，四度摇床上脱钙反应14 d。用4%多聚甲醛(PFA)在4 ℃冰箱中固定样品过夜，用组织脱水一体机将样品在乙醇/二甲苯中梯度脱水，最后浸蜡用石蜡包埋机进行包埋。用石蜡切片机切成约0.5 μm厚度的切片(小鼠指甲切片只有纵轴面上的形态是完整的，所以每个脚趾包埋的蜡块大概只能切出3～4片形态完整的切片)。将小鼠指甲的石蜡切片置于二甲苯-酒精-水梯度浓度中进行脱蜡，苏木精染色5 min后返蓝，脱水至95%酒精时染伊红60 s，继续脱水，树脂胶封片。

1.6 统计学处理

本文中的数值均以x- ±s的形式给出，并根据不同实验要求对数据进行成对或组间t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

记录数据显示，在该模型下建立的小鼠再生指甲可以恢复生长，与正常指甲长度的差异没有统计学意义(图3A)。显微镜下观察小鼠指甲HE染色切片，显示小鼠再生指甲具有与正常指甲相似的结构形态(图3B、3C)。

3 讨论

最近研究[5]显示，小鼠指甲附近的干细胞在指尖再生过程中是不可或缺的。进一步说明指甲干细胞无论是在指甲生长过程中还是在指尖再生过程中都发挥着重要作用。在Takeo等[4]研究基础上，Tabin团队[6]证明了G蛋白偶联受体Lgr6在指尖再生过程中表达必不可少。但该领域国内相关研究成果极少，造模时由于指甲内部形态结构不可见，很容易造成同组之间指甲再生情况参差不齐。本研究对指甲再生模型进行了量化优化，使造模时可以在显微镜下准确地截取至甲床的Wnt信号激活区域，为研究Wnt信号通路相关基因在指甲再生过程中的作用提供了技术保障。利用该模型，可以进一步发掘Wnt信号通路相关基因(比如G蛋白偶联受体家族)在指甲生长与指尖再生过程中的功能。Shi等[7]研究表明，keratin 15 (K15), keratin 14 (K14),keratin 19 (K19), CD29, CD34和 Lgr6可能是潜在的小鼠指甲干细胞的标记基因。可见，小鼠指甲干细胞领域具有广阔的研究前景，该模型也需要不断地优化完善，成为研究指甲干细胞的有力手段。随着该领域研究的不断成熟，在不久的将来，争取实现指甲干细胞的体外培养，为临床上手指或者脚趾截肢的患者带来治愈的新方法。

图 3 小鼠指甲再生长度统计及HE染色