甜菜突变体库的构建研究综述

包永镇，崔 杰，代翠红

(哈尔滨工业大学化学与化工学院，哈尔滨 150086)

0 前言

甜菜(Beta vulgaris L.)是二年生草本植物，属藜科(Polygonaceae)甜菜属[1]。甜菜具有一定抵御干旱、寒冷和耐盐碱的能力，是一种适应能力和抗逆能力较强的糖料作物。甜菜种植在国民经济的发展中起到积极促进的作用。如甲醇、乙醇、丁醇、甘油、谷氨酸钠和丙酮的生产，可以由经过发酵或化学处理的糖蜜来进行。它还可以用作许多药物和轻工业产品的原料，例如三磷酸腺苷、金霉素、维生素B复合物、蛋白质酵母和柠檬酸。糖生产后的过滤污泥富含钙和其他营养物质，既可作为肥料，也可作为土壤中的游离酸。甜菜茎，青头，尾根和甜菜粕可用作酿造原料、提取甜菜碱等，同时是优质多汁的饲料[2-3]。

作为一个农业大国，我国拥有的种植技术和经验十分丰富。虽然中国有野生甜菜资源，但在甜菜遗传育种方面资源仍旧匮乏，主要的方式还是依赖于引进。虽然目前有许多自主培育品种，但其生产质量仍存在一定差距。中国在五十年代到六十年代主要从自苏联、波兰和其他国家引进甜菜资源。由于品种单一，野生资源较为罕见，这在一定程度上限制了育种工作的发展[4]。另外，由于甜菜病害和盐碱土地种植会导致甜菜产量降低，如甜菜苗期主要病害立枯病、2014年我国河北省和内蒙古两地甜菜种植区纸筒育苗苗期甜菜叶片上出现的新的叶部枯斑病害[5]、甜菜褐斑病等。因而对中国甜菜糖业来讲，产糖高、耐盐碱性和抗病性强的甜菜新品种的培育至关重要。

目前，诱变育种已成功应用于许多作物品种，并建立了较全面的突变体库。但将甜菜突变体的研究应用在遗传育种的报道并不多。因此，本文将探讨甜菜突变体库的构建。

1 我国在甜菜育种方面存在的问题

中国甜菜育种存在的问题主要体现在以下几个方面：(1)虽然东北、华北和西北等主要产糖区有10多个专业甜菜种植机构，但是，这些育种机构之间的协调不够好，导致反复研究，研究内容重复含量高，研究内容难以深化等；(2)甜菜育种工作者经过数十年的引进、收集和鉴定，已有1 200多种甜菜种质资源在国内编制和编目长期保存。然而，我国现有的甜菜种质资源仍不完整，并且数量短缺。种质间遗传关系较为密切，遗传基因较窄，严重影响了我国甜菜育种的有效发展；(3)我国目前种植的甜菜品种产量不高，平均低于45 t/hm2；一些发达国家甜菜单产超过60 t/hm2；(4)中国大量种植的大多数品种都是用20世纪50年代到60年代进口的材料。目前，我们的大部分育种基础材料已经结合在一起，所以如果我们想要在育种上取得突破性的进展，很难只用现有的育种材料来做到这一点；(5)中国目前的甜菜育种技术水平与发达国家差距较大，自身育种技术较少；(6)目前，发达国家基本上使用单粒种子，中国使用的品种仍然是多粒种子[6]。

2 构建突变体库的目的与意义

突变是生物进化的重要途径和驱动力，也为品种改良提供了初始原料。突变体库是由许多不同类型的基因突变体组成的集合体。在分离和鉴定功能基因和遗传改良工作中，突变体已经成为重要的基础研究材料，通过诱变技术构建突变体文库来创造新种质资源已成为可靠有效的手段[7]。目前通过对相同环境条件下突变体与其野生型植物之间基因表达的差异进行比较，获得相关功能基因的重要信息，是一种简单、经济且有效的方法。

在国际上，基本材料的收集和基础材料的创建受到高度重视，我国在这方面也给予了相当的关注。构建甜菜突变体文库，集中各种优良性状，培育和创造近等基因系，不仅为基因功能分析提供了材料，它还可以丰富种质资源，扩大我国甜菜的狭窄基因源，促进集中鉴定和应用，使其可以直接或间接地应用于育种，为遗传研究和育种提供大量基础材料[9]。

3 甜菜突变体的构建方法

自然突变和诱导突变是产生突变体的两种方式。由于自然突变具有突变频率低、突变不定向并且大部分对生物有害等特点，目前在创建突变体的研究上多采用诱发突变。诱导突变是指利用人为方法诱导生物体的表型或遗传信息产生突变，这些突变通常用作功能基因的发现，改善培育优良的新作物品种。由于操作技术的不同，诱发突变可分为物理诱变，化学诱变，空间诱变和生物诱变。目前创造作物突变体的首要方法是诱发突变。突变频率高且有目的性，突变基因主要是一些重要的品质性状基因[11]。

3.1 物理诱变

物理诱变是指使用物理诱变剂对生物体进行处理，以引起受试对象发生表型或遗传变异的诱变方法。主要的辐射方法为电磁辐射和粒子辐射。电磁辐射包括无线电波、微波、光波、紫外线、X射线和伽马射线等。在较早的诱变试验中，人们常用的辐射源为X射线，成功制造了许多有重要研究价值的新材料。伽马射线是目前物理辐射诱变中最常用的辐射源。粒子辐射源有α粒子、β粒子、中子、质子、电子和离子束等。其中，由于高能离子束的高能量传输线密度(LET)和尖锐的布拉格峰，可以使突变频率大大提高，突变谱更为广泛。因此，它作为诱变育种研究中一种重要的技术手段具有十分广阔的应用前景。王燕飞等[12-13]将甜菜杂交种为研究材料开展甜菜种子离子注入研究，以N+作辐射源，分别使用35 kev能量，脉冲次数为40次和60次，以4×1016N+/cm2和6×1016N+/cm2为注射剂量分别进行辐射诱变。对甜菜杂交种的分析研究表明，杂交种的产量和含糖量均明显提高，经过6年的130次实验，获得了267个测试数据，并获得了一份创新的早熟亲本材料，两种具有优良综合性状的创新亲本材料，表现为产量和含糖量增加[14]。张月琴和马龙珍对未授粉的甜菜胚珠及其产生的愈伤组织进行紫外线照射处理，并以一定浓度的褐斑病粗提物进行选择处理，获得了具有抗甜菜褐斑病的甜菜品种；韩晓云等对培甜菜与白花甜菜杂交及回交得到的异源三倍体与栽培甜菜回交得到的单体附加系M14的种子进行γ射线照射，使易位系的产生速度增加，使易位系的频率从0.3%增加到2.3%[15-16]。

3.2 化学诱变

操作方便、成本低廉是化学诱变技术的主要特征。化学诱变剂主要包括碱基类似物(如5-溴-尿嘧啶)，烷化剂(如EMS)，抗生素等[17]。化学诱变技术是构建突变体文库的重要手段之一。化学诱变剂直接通过化学作用在染色体中起重要作用。甲基磺酸乙酯(EMS)是公认最好的化学诱变剂之一，利用EMS作为诱变剂创造突变体已成为世界上成熟的技术。其诱变机理是通过与核苷酸中的磷酸和嘌呤或嘧啶作用，从而诱导突变的发生。EMS诱导产生突变体分为两步：第一步是鸟嘌呤的C6位发生烷基化，第二步是在DNA进行复制过程中，被烷基化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶进行配对，从而发生碱基交换，即碱基对由G：C转变为A：T，造成点突变。由于EMS诱变技术多是由点突变的发生而制造突变体，不易导致染色体畸变的发生，因此构建突变体文库多采用EMS诱变。目前，已经对拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米、番茄和大麦中等植物利用 EMS诱变技术进行了突变体库的构建，并且进行了相关功能基因组学的研究。1994-1996年，齐桂杰等人用秋水仙碱诱导了42份甜菜四倍体稳定系。选择了三条高产品系列和八条高糖系列，为甜菜多倍体育种创造了有价值的研究材料[18]。姜莉等确定了甜菜授粉系材料SN9807种子萌发致死率(半致死剂量)，最佳诱变处理组合为时间10 h、EMS浓度2.5%和时间12 h、EMS浓度2.3%[19]。

3.3 空间诱变

植物空间诱变是指将植物材料通过返回的卫星和高空气球携带到离地球20至400公里的高度飞行，通过宇宙射线、微重力、弱地磁等对作物材料进行诱变处理，然后返回地面种植和育种，以获得优良的新品种或特殊种质材料[20]。自1987年以来，卫星或宇宙飞船携带了100多种植物的1000多种种子和组织培养苗，包括大米、小麦、大麦、高粱、玉米、棉花、甜菜、莲子等。刘华军、王燕飞等选择培育纯合二倍体系B63，四倍体系7208于1996年乘坐回归卫星。试验结果显示，不同多倍体的甜菜种子的敏感性经过空间诱变处理后表现出明显的不同。与对照相比，四倍体材料在生长过程中表现出某些性状受到抑制，生长期延迟，种子干粒重减少5%～25%，块根产量下降26.5%～47%；而二倍体材料的生长却表现出明显的促进作用，并且生长潜力得到提升。初步研究分析表明，外太空环境不仅影响植物的生理状态，还影响植物的遗传[21]。刘乃新等测定了经空间诱变处理的3个不同品种的甜菜及其对照材料花蕾组织中4种激素(IAA，GA3，ABA和ZR)的含量，结果表明：与对照相比，在甜菜的生殖生长阶段，空间突变株中的激素含量发生了很大变化，然而，不同品系之间存在一定的差异，表明在复杂的环境条件下，不同的个体变体是多样的，需要进一步的研究来阐明其突变的机制[22]。

3.4 生物诱变

生物诱变是指采用生物工程方法对生物遗传信息进行编辑和转化以诱导突变的研究方法。由插入序列产生的突变通常用于增加或减少基因的表达或通过外源或内在插入植物基因组DNA中来删除基因的功能。T-DNA插入突变，转座子标签，基因沉默等是主要的生物诱变技术。生物诱变技术尚未见在甜菜育种应用方面进行报道，但在其他作物育种中已进行了较多的应用。

4 结语

经过多年的发展，甜菜诱变育种技术取得了一定的进展，但作为非甜菜原产国的中国，种质资源相对较少，甜菜诱变育种技术的发展对中国来说还远远不够。我国目前对于甜菜突变体库的研究比较薄弱，而且最近有关甜菜突变体构建的报道极其微少，很多报道都是多年以前的研究。目前拥有的优质甜菜材料的数量和类型完全不能达到对甜菜功能基因组学研究和遗传育种的需要。因此，我们应该加强各种类型突变的创造，并研究突变体和对照之间农艺性状，质量和抗逆性的差异。为功能基因组学的研究构建各种不同类型的突变体库；利用诱变技术获得新的遗传性状和种类，为遗传育种和新的种质资源研究提供充足的基础材料。