甜菜耐盐相关转录因子WRKY及组氨酸激酶研究进展

王琮玉，崔 杰，李俊良，李昕晏，罗成飞

(哈尔滨工业大学化工与化学学院，黑龙江 哈尔滨 150086)

0 前言

土壤盐渍化和干旱化是威胁全球作物产量和品质的主要原因。因而，作物耐盐及耐旱分子机理研究已成为农业科学的热点。近年来研究表明植物中有一些基因、转录因子参与盐和干旱胁迫应答。植物在长期进化过程中，为适应和抵御形式多样的生物和非生物逆境以及调节自身生长发育，形成了一系列复杂的基因表达调控网络或信号通路，而这些信号通路的建立最初依赖于众多转录因子表达激活及其对下游靶基因表达水平的调控。拟南芥，水稻和其他植物的基因表达分析表明，应激反应基因可分为两类：效应基因和调控基因。这两类基因的产物，分别为功能蛋白(function proteins)和调节蛋白(regulatory proteins)。功能蛋白包括胁迫反应中与蛋白质代谢有关的酶，活性氧清除的酶，小分子渗透保护剂(脯氨酸、甜菜碱等)合成的酶以及大分子渗透保护的蛋白，如脱水蛋白(dehydrin)、渗调蛋白、分子伴侣、LEA等。调节蛋白包括与胁迫信号转导和基因表达有关的蛋白质，如蛋白激酶、转录因子等效应基因编码最有可能直接保护的蛋白质，如渗透物生物合成的关键酶，抗氧化剂和活性氧物质(ROS)的清除剂，分子伴侣，晚期胚胎发生丰富的蛋白质，离子和水通道蛋白，以及参与的酶[1]。已经发现几个转录因子家族在植物胁迫耐受中起重要作用，例如DREB，ERF，WRKY，MYB，bZIP和NAC家族。这些转录因子分别或协同地影响许多代谢过程下游基因的表达，并构成用于应激适应的基因网络。植物在水分胁迫条件下以依赖ABA和不依赖ABA的基因表达途径来调节对逆境的适应。植物通过渗透感受器感知胁迫信号，以MAPK和CDPK等途径传递信号,最终引起基因表达[2]。

1 高等植物转录因子的作用

1.1 转录因子的结构与功能

转录因子又叫反式作用因子，能与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性结合并相互作用，通过这种互作对基因的表达起到激活或抑制效应的DNA结合蛋白。转录因子结构上分为DNA结合区、转录调控区、核定位信号区、寡聚化位点。转录因子通过这些功能域与启动子顺式作用元件结合或与其他蛋白的相互作用来激活或抑制基因的表达。DNA结合区是指转录因子识别DNA顺势作用原件并与之结合的一段氨基酸序列，相同类型的转录因子的DNA结合区的氨基酸序列较为保守[2]。

1.2 转录因子在植物盐胁迫中的作用

基因是控制植物一切性状的核心，由于高等植物本身其盐胁迫诱导反应受多种信号途径的调控，并且不同胁迫反应的信号途径及其相关基因的表达调控上存在着交叉，因而转录因子之间、转录因子与靶基因之间都存在着复杂的相互作用。近年来随着基因组测序技术的发展，不同非生物逆境的抗性基因的研究也取得了不少成果，耐盐抗性基因的研究一直都很受专家学者的欢迎。目前耐盐相关转录因子家族包括：MYB、NAC、WRKY、AP2、ERF、bHLH、bZlP、C2H2等，已经得到证实。WRKY转录因子主要结构特点是DNA结合域中都至少含有一个WRKY结构域，该结构域是由大约60个氨基酸残基组成，N端具有高度保守的被视为核心序列的WRKYGQK，C端为一个C2H2或C2HC型的锌指类似结构(zinc-finger-like motif)。它们通过结合靶基因启动子区域的W-box[(T)TGACC(A/T)]核苷酸序列而进行基因表达的调控，在植物的进化中起到重要的作用[3]。

2 WRKY转录因子在植物抗逆中的作用

2.1 WRKY转录因子在盐胁迫中的作用

干旱经常导致高盐条件，导致高渗透压。AtWRKY25和AtWRKY33双突变体易受NaCl和任一基因的过表达赋予对NaCl的应力。实验证明Dendranthema grandiflorum WRKY基因DgWRKY1或DgWRKY3的过表达增强了它们对烟草的耐盐性。盐胁迫诱导的过氧化氢(H2O2)和丙二醛的积累减少，同时DgWRKY1中的抗氧化酶活性较低，包括超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)等[4]。

2.2 WRKY转录因子在脱落酸信号转导中的作用

ABA是一种应激激素，在植物对非生物胁迫的反应中起着重要作用。先前的研究已经证明WRKY蛋白可以作为ABA信号传导中的激活剂或抑制剂。在干旱胁迫条件下，通常植物体内的ABA水平上升，叶片气孔关闭以保持细胞内的水分。研究表明，在拟南芥中，AtWRKY25和AtWRKY33改善了转基因植物的耐盐性，同时提高了对脱落酸(ABA)的敏感性。进一步遗传学分析显示，WRKY40可能直接抑制的几个重要的ABA应答基因，如AtABF4，AtABI4，AtABI5，AtDREB1A，AtMYB2和AtRAB18，通过直接结合到W-Box序列位于其启动子的上游。高水平的ABA可以从细胞核招募AtWRKY40到细胞质并促进ABA受体-WRKY40相互作用，从而减轻ABA反应的相关基因的表达，最终发生ABA反应[5]。

2.3 WRKY转录因子可以与其它转录因子相互作用

GmWRKY27通过与其启动子区域中的W盒结合来抑制下游基因GmNAC29的表达。GmNAC29是胁迫耐受性的负面因子，GmWRKY27与GmMYB174相互作用也会减少GmNAC29在大豆植物中的胁迫耐受性的表达GmWRKY27和GmMYB174可能已进化为与GmNAC29中的邻近顺式元件结合启动子共同降低启动子活性和基因表达[6]。

3 组氨酸激酶在植物抗逆中的作用

3.1 拟南芥组氨酸激酶

原核生物是通过双组分系统(由传感蛋白和反应调节蛋白组成)来感知细胞外各种信号刺激的。双组分系统由两个基本组分构成:一个是组氨酸激酶(HK),另一个是响应调节蛋白(response-regulator protein,RR)。这种被称为“双组分信号系统(two componentsystem)的信号系统，在细菌、酵母菌都广泛存在，例如，大肠杆菌中存在的EnvA-OmpR系途径来感知高渗胁迫，而酵母菌的二元调控体系包括三个成员：SLN1、YPD1和SSK1[7]。

高等植物中的双组分系统已经得到证实，由HK，HPt、RR三部分组成。在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)具有约13000个基因，其中有17个基因编码组氨酸激酶(AtHK)，5个编码Hpt蛋白(AtHP)，23个编码反应调控因子(AtRR)[8]。

1999年Urao等分离到编码AtHK1的cDNA，并证实该基因位于拟南芥第2染色体上。AtHK1是拟南芥里组氨酸激酶家族的成员之一,其cDNA全长4040bp推算它可编码1207个氨基酸残基，分子量135KD。AtHK1蛋白质具有组氨酸残基的信号转导域和保守的Asp残基的受体区域疏水性分析表明AtHK1在N端具有两个疏水域,说明AtHK1是膜蛋白。该受体与G-蛋白偶联。从同源性比较结果得出AtHK1与酵母组氨酸激酶具有30%的相似性,结构分析也表明它与酵母组氨酸激酶在结构上也有一定相似性。将AtHK1导入酵母组氨酸激酶突变体(SLN1)免疫分析法检测组氨酸激酶下游HOGIMAPK的Tyr磷酸化情况,证实在酵母细胞中AtHK1具有对渗透的感受功能，但AtHK1是否是植物渗透感应器,是否参与植物的抗渗透胁迫反应,至今仍无确切的直接证据[9]。

3.2 组氨酸激酶在干旱胁迫响应中的分子机理

2004年郝刚平等人对AtHK1的氨基酸序列分析表明，它是一种跨膜的组氨酸蛋白激酶受体，可以作为渗透感受器把胁迫信号传向下游的MAPK级联反应，并且通过DDRT-PCR的方法证明AtHK1是MAPK信号上游传递成员。通过PEG处理的方法，认为AtHKl蛋白与异三聚体G蛋白在同一途径起作用，且AtHK1蛋白位于G蛋白下游[10]。Chen等通过农杆菌转化方法，将AtHK1的全部编码序列引入枸杞中，并且发现与野生型相比，转基因植株耐受高浓度的NaCl后脱水，再浇水后恢复的较快。且经盐胁迫或水胁迫之后转基因植株的含水量、脯氨酸和可溶性蛋白水平相对较高，叶绿素损失和膜离子泄漏较低。此外，还降低了过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子自由基(O2-)和脂质过氧化反应，增加超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性，显示出了较高的抗氧化能力。由此证明，AtHK1提高了枸杞对干旱和盐胁迫的耐受性[11]。

在植物中渗透压感受系统由有双元系统组成的渗透压感受器是通过称为组氨酸-天冬氨酸激酶的信号机制来介导的。组氨酸蛋白激酶(histidine kinase,HK)位于质膜，分为感受胞外刺激的信号输入区域和具有激酶性质的转运区域。当输入区域接受信号后，转运区域激酶的组氨酸残基(His)发生磷酸化，并将磷酸基团传递给下游组分，HK转运区域下游有一个接收区域，具有可以传递磷酸基团的天冬氨酸残基。HK的磷酸基团转移给了下游的组氨酸磷酸转移蛋白(Hpt)，它接收HK传来的磷酸基团后，进一步传递给下游的RR。应答调控蛋白(response-regulator protein,RR)也有两个部分：一个是接收区域，由天冬氨酸残基(Asp)接受磷酸基团；另一部分为信号输出区域，将信号输出给下游组分(通常是转录因子)，以此调控基因表达[12]。

当植物在生长过程中遇到高盐环境时，双组分系统中组氨酸激酶经过一系列的信号传导，激活MAPK级联反应，通过磷酸化作用最终激活某些抗盐胁迫相关的基因表达[13]。

4 甜菜中的WRKY转录因子、组氨酸激酶的研究进展

转录因子作为盐胁迫中重要的一员，引起了甜菜研究者的广泛关注，并且对其在盐胁迫中的作用进行了研究。目前对甜菜的WRKY转录因子和组氨酸激酶进行的研究并不是很多。

孔维龙等通过生物信息学手段对甜菜WRKY转录因子全基因组鉴定，同时也对不同非生物胁迫的WRKY基因表达量进行定量分析。发现了BvWRKY1、BvWRKY6、BvWRKY19、BvWRKY31、BvWRKY33在盐胁迫中表达量有所提高[14]。除了上述基因在盐胁迫中有所增高，在盐处理过的O“68”品系中经定量分析发现BvWRKY4、BvWRKY9、BvWRKY10、BvWRKY11、BvWRKY14、BvWRKY15、BvWRKY18、BvWRKY20、BvWRKY22、BvWRKY23、BvWRKY25、BvWRKY26、BvWRKY33、BvWRKY37、BvWRKY38、BvWRKY39、BvWRKY40也均有显著增高。总的来说，之前的研究对甜菜中WRKY转录因子的研究还不是很透彻，目前仍然需进一步研究。

甜菜中的组氨酸激酶已经通过生物信息学手段与拟南芥中的组氨酸激酶经过BLAST分析得出相似基因(NC_025817)，经过ORF分析，发现与组氨酸蛋白激酶histidine kinase 1 [Beta vulgaris subsp.vulgaris](ACCESSION XP_010679909)CDS完全重合。该蛋白激酶分子量为135KD。经过蛋白质的二级结构分析发现蛋白中存在螺旋跨膜区域，表明该蛋白存在于细胞膜上。通过swiss-modle分析蛋白的三级结构，得到对蛋白的描述为传感器蛋白质CpxA，其配合基为ATP。但目前对于其在甜菜中的表达情况和抗盐胁迫的作用了解还很少。并且，甜菜中的组氨酸激酶与WRKY转录因子是否存在相互作用也值得进一步研究。