袋鼠疱疹病毒1型实时荧光PCR方法的建立

王建华，王玉玲，柴铭骏，张俊哲，赵 丹，王乃福，陈本龙

（天津海关，天津 300456）

袋鼠（Kangaroo）是分布于澳大利亚和巴布亚新几内亚部分地区的有袋类动物，主要包括红袋鼠、大赤袋鼠、东部灰大袋鼠和麝香袋鼠等品种，在我国一些动物园内也有少量人工繁养。近年来，袋鼠作为一种观赏动物日益获得人们的喜爱，进口的袋鼠数量在逐年增多。疱疹病毒（Herpevirus）是引发多种动物疫病的重要病原体[1]。20世纪70年代，澳大利亚研究人员从发生致死性呼吸道感染和多系统衰竭的袋鼠肾组织中分离出疱疹病毒，定名为袋鼠疱疹病毒1型（Macropodid herpesvirus 1，MaHV-1）[2]。目前已知这种病毒主要引起袋鼠以鼻炎、结膜炎、肺炎、肝坏死和泄殖腔溃疡为特征的多系统疾病，对袋鼠健康及种群发展构成一定威胁[3-5]。Paola等[6]首先报道了MaHV-1的全基因组序列，发现该病毒基因组长约140 kb，与人的疱疹病毒1型具有67%的核酸同源性，含有66个与其他疱疹病毒同源的开放阅读框（ORF），其中的gB基因序列长2 664 bp，编码由887氨基酸组成的与疱疹病毒同源的gB糖蛋白。为保护国内动物园袋鼠种群的生命健康，按照双边动物贸易协定要求，我国口岸动物检疫机构需对进境袋鼠实施MaHV-1检疫。对袋鼠疱疹病毒的检测，目前仅有澳大利亚建立了病毒分离鉴定试验、血清中和试验和常规PCR试验这3种检测方法[5]。事实上，国内由于缺乏MaHV-1及血清中和抗体，无法进行病毒分离鉴定和血清中和试验。为满足我国对进境袋鼠疱疹病毒的检疫要求，本研究以MaHV-1 gB基因为扩增靶序列，设计特异性引物和TaqMan探针，建立了MaHV-1实时荧光PCR检测方法。该方法具有特异、敏感和快速的优点，为进境袋鼠疱疹病毒检疫提供了一种有效的技术手段。

1 材料与方法

1.1 病毒核酸和主要试剂

禽传染性喉气管炎病毒（ILTV）、伪狂犬病毒（PRV）和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）核酸材料：由天津海关动植物与食品检测中心反刍动物检疫实验室保存。TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0、Premix Ex Taq™（Probe qPCR）：购自宝生物工程（北京）有限公司。其他试剂均为国内或进口分析纯试剂。

1.2 引物和探针设计与合成

根据GenBank发表的MaHV-1基因序列（AF061754），应用Beacon Designer 7.0软件辅助设计多对特异引物和TaqMan探针，探针5'端用VIC标记，3'端用BHQ1标记，由Sangon Biotech公司合成。经预试验确定的引物及探针序列见表1，预期扩增片段长度为105 bp。

表1 引物与探针序列

1.3 阳性标准质粒制备

根据GenBank发表的MaHV-1 gB基因序列（AF061754），选取一段包含上、下游引物和探针序列在内的扩增靶序列，长度为150 bp，送上海捷瑞生物工程有限公司合成并插入至pCR2.1克隆载体中，经测序确证后作为阳性标准质粒对照，命名为pCR2.1- MaHV-1-gB，用核酸蛋白分析仪测得该阳性标准质粒对照的浓度为8.3×109copies/μL。

1.4 引物对和探针组合筛选及反应条件优化

用灭菌水将引物和探针分别稀释至2.0～10.0 pmol/μL和1.0～4.0 pmol/μL的 工 作浓度范围，以8.3×104copies/μL的pCR2.1- MaHV-1-gB为扩增模板，按照Premix Ex Taq™（Probe qPCR）试剂盒说明书，在Light Cycler® 480荧光PCR仪（Rochi公司）仪上，采用方阵试验筛选最适引物对和探针组合及工作浓度，然后再筛选最适退火延伸温度及反应时间。

1.5 标准曲线绘制

对pCR2.1-MaHV-1-gB（8.3×109copies/μL）进行10 倍系列稀释，选择8.3×100～8.3×108copies/μL浓度范围的稀释质粒作为模板，按照优化后的反应条件进行扩增。反应结束后，以Ct值为横坐标，pCR2.1-MaHV-1-gB模板起始拷贝数浓度的对数为纵坐标，绘制定量标准曲线。

1.6 敏感性、重复性和特异性试验

对pCR2.1-MaHV-1-gB进行10倍系列稀释，按照优化后的反应条件进行荧光RT-PCR扩增，以确定该方法的最低检出限。选取8.3×103、8.3×104和8.3×105copies/μL的pCR2.1-MaHV-1-gB，按照优化的荧光PCR方法进行组内与组间试验，每个浓度的模板做3个平行检测，以确定本方法的重复性。以pCR2.1-MaHV-1-gB以及ILTV、PRV和IBRV Bartha Nu/67株的核酸材料为模板，按照优化后的反应条件进行荧光RT-PCR扩增，以确定该方法的特异性。

2 结果

2.1 引物对和探针组合筛选及反应条件优化

以浓度为8.3×104copies/μL的pCR2.1-MaHV-1-gB为模板，使用Premix Ex Taq™（Probe qPCR）试剂，对多个引物对和探针组合进行荧光PCR筛选试验，以出现最典型S型扩增曲线和最小Ct值为选取标准，最终确定的引物对和探针组合见表1。通过优化上、下游引物和探针的浓度及反应参数，确定实时荧光PCR的最适反应体系为： 2×Premix Ex Taq™ 12.5 μL，上、下游引物（5 pmol/μL）各1.0 μL，探针（2 pmol/μL）1.0 μL，模板1 μL，用ddH2O补足至25 μL。反应参数为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，45个循环。扩增曲线见图1。

图1 pCR2.1- MaHV-1-gB（8.3×104 copies/μL）荧光PCR动力学曲线

2.2 定量标准曲线及最低检出限

以8.3×100～8.3×108copies/μL浓 度 范 围的标准阳性对照质粒为扩增模板，按优化反应条件进行荧光PCR 反应，扩增曲线见图2。在8.3×101～8.3×108copies/μL浓度范围，以起始模板浓度的对数为X轴，Ct 值为Y轴绘制成的标准曲线见图3。Ct 值与pCR2.1-MaHV-1-gB拷贝数之间的线性关系表达式为：Y= -3.276 3X+37.545，相关系数（R2）为0. 998 9，呈现良好的线性关系。

2.3 最低检出试验

对10倍系列稀释的pCR2.1-MaHV-1-gB（8.3×100～8.3×108copies/μL），各取1 μL为模板，按优化后的反应条件进行荧光RT-PCR 反应，扩增曲线见图2。由图2和图3可知，该方法最低可检出8个拷贝的PCR2.1-MaHV-1-gB。

2.4 重复性试验

重复性试验结果（表2）显示，3个浓度的PCR2.1-MaHV-1-gB组内与组间试验的Ct值变异系数介于0.17%～0.96%，表明本试验所建立的荧光PCR检测体系稳定，具有良好的重复性。

2.5 特异性试验

图2 pCR2.1-MaHV-1-gB（8.3×100～8.3×108 copies/μL）的荧光PCR扩增曲线

图3 pCR2.1-MaHV-1-gB（8.3×100～8.3×108 copies/μL）的标准曲线

表2 荧光PCR重复性试验结果

用所建立的方法同时对ILTV、PRV和IBRV的核酸材料以及PCR2.1-MaHV-1-gB进行检测，发现仅有阳性标准质粒对照呈现典型的扩增曲线，而ILTV、PRV和IBRV等核酸材料均无扩增曲线出现（图4），表明本研究建立的荧光PCR方法具有良好的特异性。

3 讨论与结论

图4 荧光PCR 特异性试验结果

澳大利亚早期流行病学研究结果显示，约有23 %的野生袋鼠血清中存在MaHV-1中和抗体[7]，表明MaHV-1感染在野生袋鼠中并非罕见。为保护国内动物园袋鼠的种群健康，防止MaHV-1随进境袋鼠传入，特别是在国内缺乏袋鼠疱疹病毒血清学诊断试剂的情况下，开展袋鼠疱疹病原检测方法的研究具有实际应用价值。荧光PCR方法具有快速、敏感和特异的优点，已逐步取代常规PCR方法，被广泛用于各种动物的病原体检测，但用于袋鼠MaHV-1检测的实时荧光PCR方法还未见报道。为此，本研究基于GeneBank 公布的MaHV-1 gB基因序列，设计特异性引物和TaqMan探针，建立了一种检测MaHV-1的实时荧光PCR方法。试验结果显示，该方法对MaHV-1 gB基因呈现特异性扩增反应，不与ILTV、PRV和IBRV等疱疹病毒发生交叉反应，最低检出限达8个拷贝数的pCR2.1-MaHV1-gB，具有良好的特异性和敏感性。近3年来，采用本研究建立的荧光PCR方法，对346份袋鼠鼻拭子样品进行MaHV-1核酸检测，并未发现阳性，与对照结果相符，表明该方法可用于进境袋鼠临床样品MaHV-1的病原学检测。本方法的建立为进境袋鼠疱疹病毒检疫提供了一种有效的技术支撑。