弓形虫GT1虫株GRA15蛋白的表达及其反应原性分析

周芃来，马叶婷，李润丽，李 瑾，高文伟，刘 卿

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801）

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）几乎能感染所有温血动物，引起危害严重的，呈世界性流行的人兽共患弓形虫病[1]。据统计，全球约有33%的人口感染弓形虫，我国人群弓形虫感染率约为7.88%[2-3]。免疫功能正常的人感染弓形虫后，一般无明显临床症状，但是免疫功能低下或缺陷者（如孕妇及HIV患者等）感染后，会遭受致命的伤害甚至死亡[4-5]。孕畜感染弓形虫后，会发生流产，产死胎或畸胎等，给畜牧业带来较大经济损失[6]。同时，弓形虫病作为一种食源性人兽共患原虫病，可通过污染的动物源性食品，随人类消费而传播。

弓形虫感染宿主细胞离不开三大分泌细胞器，分别为微线体、棒状体和致密颗粒[7]。致密颗粒细胞器分泌的致密颗粒蛋白（Dense granule antigens，GRAs）目前已鉴定出约30种。其中，有些致密颗粒蛋白已被证实是较好的弓形虫诊断抗原，更重要的是其中一些多态性蛋白可用于弓形虫的血清学分型，例如GRA3、GRA6和GRA7蛋白[8-10]。弓形虫GRA15蛋白也是多态性蛋白，但是目前没有关于这方面的研究报道[11]。本研究通过表达纯化弓形虫GT1虫株GRA15（GRA15GT1）蛋白，并对其免疫反应原性进行分析，以期为基于GRA15蛋白的弓形虫诊断及血清学分型试剂的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 虫株cDNA、菌种及质粒

弓形虫GT1虫株的cDNA：由本实验室保存；原核表达载体pGEX-6p-1：购自山西赛奥生物科技有限公司；DH5ɑ及BL21大肠杆菌感受态细胞：购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 主要试剂

胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒及DAB显色试剂盒：购自天根生化科技有限公司；限制性内切酶、PrimeSTAR Max Premix（2×）及rTaq酶：购自大连Takara公司；Protein GST Resin：购自全式金生物科技有限公司；抗GST标签鼠单克隆抗体：购自康为世纪生物科技有限公司；IHA间接血凝试剂盒中的猪弓形虫阳性血清：购自中国农业科学院兰州兽医研究所；羊抗鼠HRP标记二抗：购自北京奥博森生物技术有限公司；HRP标记的羊抗猪二抗：购自美国Proteintech Group公司；PAGEMASTER Protein Standard蛋白Marker：购自南京金斯瑞生物科技有限公司；PageRuler Prestained Protein Ladder：购自美国Thermo Scientif i c公司。

1.3 引物设计

依据ToxoDB数据库（http://toxodb.org/toxo/）和NCBI数据库基因信息，采用Primer 6.0软件设计特异性引物扩增弓形虫GT1虫株的GRA15基因，上游引物P1序列为5'-GGGGGATCCATAATTCGGTGGCTTGGGTATCTTAC-3'，下游引物P2序列为5'-GGGGAATTCTCATGGAGTTACCGCTGATTGTGTG-3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 GRA15GT1基因扩增

以弓形虫GT1虫株的cDNA为模板，用Prime STAR Max DNA Polymerase进行PCR扩增，25 μL反应体系为：Prime STAR Max Premix（2×）12.5 μL，引物P1/P2各0.25 μL，模板 1 μL，灭菌水 11 μL。PCR反应条件为：98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s，共30个循环。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收切下目的片段。

1.5 pGEX-6p-1-GRA15GT1载体构建

对回收的GRA15GT1基因加A尾，25 μL的反应体系和条件如下：GRA15GT1基因回收产物19.5 μL，rTaq酶0.5 μL，LA Buffer 2.5 μL，dNTP Mix 2.5 μL，72 ℃ 30 min，经0.8%琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带。将加A尾的GRA15GT1基因连接至T Vector pMD19（Simple）载体中，转化DH5ɑ感受态细胞，菌液PCR鉴定为阳性的提取质粒，并送上海生工生物工程有限公司测序，将测序正确的质粒命名为pMD19T-GRA15GT1。

对pMD19T-GRA15GT1载体用BamHI和EcoRI进行双酶切，回收目的条带。将目的基因连接至经同样酶切处理的pGEX-6p-1载体，并转化入DH5ɑ感受态细胞。菌液PCR鉴定为阳性的提取质粒，并进行双酶切和测序鉴定，将鉴定正确的质粒命名为pGEX-6p-1-GRA15GT1。

1.6 GRA15GT1融合蛋白表达及纯化

将pGEX-6p-1-GRA15GT1重组质粒转化BL21，将菌液PCR鉴定正确的菌液按1:50的比例接种到8 mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃ 220 r/min，培养至菌液OD600达到0.6时，吸出2 mL菌液作为对照，剩余菌液加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，37 ℃ 220 r/min，诱导6 h；分别将2 mL对照组菌液和诱导表达的菌液进行超声破碎，离心收集破碎后的上清和沉淀，分别加入蛋白上样缓冲液后100 ℃煮沸5 min。然后进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后观察蛋白是否表达及分析可溶性。

小量诱导验证GRA15GT1融合蛋白为可溶性表达后，收集500 mL诱导菌液，8 000 r/min离心3 min，收集菌体，用PBS清洗3次，加入适量PBS重悬后进行超声破碎，然后离心收集破碎后的上清；采用全式金的Protein GST Resin试剂盒纯化GRA15GT1融合蛋白。

1.7 Western blot分析

将纯化后的GRA15GT1融合蛋白经SDS-PAGE电泳后转移到PVDF膜上（共两张膜，每张膜均转有GRA15GT1融合蛋白），用2.5%的脱脂奶粉封闭液37 ℃封闭2 h。用PBST洗膜后，第1张膜加入1: 3 000稀释的抗GST标签蛋白的鼠单克隆抗体，37 ℃孵育2 h，用PBST洗膜后再加入1: 6 000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，37 ℃孵育1 h；第2张膜加入1: 300稀释的猪抗弓形虫阳性血清，用PBST洗膜后再加入1: 5 000稀释的HRP标记的羊抗猪二抗，37 ℃孵育1 h。用PBST洗膜后加入DAB显色液，避光显色5～10 min后用蒸馏水终止反应，观察结果。

2 结果

2.1 GRA15GT1基因扩增

以弓形虫GT1虫株的cDNA为模板进行PCR扩增，获得与预期一致的1 755 bp的片段（图1）。

图1 GRA15GT1基因扩增产物电泳结果

2.2 pGEX-6p-1-GRA15GT1酶切及测序鉴定

用BamHⅠ 和EcoRⅠ 对pGEX-6p-1-GRA15GT1质粒进行双酶切鉴定。由图2可见：一条大小为4 984 bp，与pGEX-6p-1的线性片段大小一致；另一条大小为1 755 bp，与弓形虫GRA15GT1基因大小相符。测序结果与理论序列的比对结果一致。

图2 pGEX-6p-1-GRA15GT1质粒酶切鉴定

2.3 GRA15GT1融合蛋白表达及纯化

诱导前和诱导后的表达菌经超声破碎后离心，分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析。结果显示，诱导表达菌破碎离心后的上清与对照组相比，在80～120 kDa处有特异性条带。诱导表达菌破碎离心的上清经纯化后，进行SDS-PAGE电泳分析，发现在100 kDa处有单一条带，比理论值87 kDa稍大（图3-a）。纯化蛋白利用小鼠抗GST标签抗体作为一抗进行免疫印迹反应，发现有特异性条带，且大小与SDS-PAGE电泳结果一致（图3-b）。

图3 纯化的GRA15GT1融合蛋白表达分析

2.4 GRA15GT1融合蛋白反应原性的Western blot分析

对纯化蛋白利用猪弓形虫阳性血清作为一抗进行免疫印迹反应，发现有特异性条带，且大小与SDS-PAGE电泳结果及利用小鼠抗GST 标签抗体作为一抗进行的免疫印迹反应结果一致（图4）。

图4 Western blot分析GRA15GT1融合蛋白反应原性

3 讨论

弓形虫病是危害严重的人兽共患原虫病，做好弓形虫病诊断及掌握其流行病学资料对于该病防控具有重要意义。弓形虫病诊断方法主要有临床诊断、病原学诊断、PCR诊断及血清学诊断等[12-13]。弓形虫病的临床症状与某些传染病相似，单靠临床症状难以诊断[5，14]。病原学诊断依赖于显微镜检查，然而，仅基于光镜的虫体辨别是不敏感、不可靠的。电镜也用于检测小鼠脑组织囊肿和感染猫小肠卵囊，但难以常规使用[15-16]。PCR技术因具有特异、敏感、快速等优点，已普遍应用于弓形虫病诊断和流行病学调查[17]，更重要的是PCR可用于弓形虫不同虫株的分型[12]，但PCR技术在进行非卵囊样品的流行病学调查时存在缺陷，如需要活体动物组织等。

血清学诊断是进行弓形虫流行病学调查的重要手段，适合大规模样品检测，方法包括改良凝集试验（MAT）、间接血凝实验（IHA）及ELISA等[2，18-20]。其中，ELISA方法可用抗原（速殖子裂解抗原或重组表达抗原）或抗体对弓形虫感染情况进行检测，例如SAG1、MIC1、MIC3及GRA3等重组表达抗原[21-23]。致密颗粒蛋白在弓形虫入侵过程中不发挥作用，其在虫体侵入宿主细胞形成纳虫泡后才开始分泌。弓形虫入侵宿主细胞时分泌的蛋白虽然可引起机体免疫反应产生抗体，但最终可能被灭杀而未在宿主细胞内增殖。鉴于此，使用致密颗粒蛋白而不是入侵相关蛋白（如微线蛋白）作为诊断抗原，可能检测结果更准确。但是目前未有关于弓形虫GRA15GT1蛋白免疫反应原性的报道。本研究表明，GRA15GT1蛋白能够成功地与猪弓形虫阳性血清反应，从而丰富了诊断弓形虫感染的可用抗原。

基于弓形虫多态性蛋白的ELISA方法可用于弓形虫的血清学分型，例如GRA3，GRA6和GRA7蛋白等[12]。但是目前没有关于弓形虫多态性GRA15蛋白血清学分型方面的研究。GT1虫株GRA15蛋白与PRU虫株及RH虫株的GRA15蛋白相比，均存在共有肽段，因此本研究表达和分析了GRA15GT1蛋白的免疫反应原性[11]。该研究是评价GRA15GT1蛋白在GT1虫株、PRU虫株及RH虫株血清学分型中应用的前提。

4 结论

本研究成功表达了弓形虫GT1虫株GRA15蛋白，经Western blot分析显示，该蛋白能够与猪弓形虫阳性血清反应，表明表达的GRA15GT1蛋白具有较好的反应原性。这为下一步分段表达GRA15GT1蛋白，研究其在弓形虫血清学分型中的应用奠定了基础。