癌相关成纤维细胞对肿瘤生长发展影响及其靶向制剂应用的研究进展

刘玉贤，罗泊涛，陆元志

(1 广东医科大学，广东湛江 524023；2 广东医科大学附属医院)

近年来，随着分子肿瘤学研究进展，人们越来越多地认识到肿瘤的发生发展不仅取决于肿瘤细胞自身基因组学和表观遗传学改变的积累，更重要的是受肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TEM)的影响。TEM主要由细胞外基质及各种基质细胞如炎症免疫细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、间充质干细胞、肿瘤相关巨噬细胞等组成[1]。已发现，TEM参与肿瘤细胞许多生物学行为，包括生长、侵袭、转移、耐药、细胞干性、免疫反应等。癌相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAFs)是肿瘤间质中活化的成纤维细胞，为肿瘤微环境中最主要的细胞成分之一，在肿瘤细胞生长、侵袭和转移等过程中发挥着重要作用。近年来，针对CAFs的研究已经成为肿瘤生物学转化研究领域的热点，并有望成为肿瘤治疗新靶点。现就CAFs对肿瘤生长发展影响及其靶向制剂应用的研究进展综述如下。

1 CAFs的来源及与癌细胞的相互作用

1.1 CAFs的来源 成纤维细胞是间充质来源的非上皮细胞，生理条件下呈典型的纺锤形或梭形，是构成结缔组织的基本成分。正常组织中的成纤维细胞处于静息状态，增殖缓慢、代谢能力低，在炎症及创伤刺激下，成纤维细胞被激活。活化成纤维细胞能分泌胶原蛋白、纤维连接蛋白、层黏连蛋白及基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)等成分，参与调节炎症反应及创伤修复，但损伤组织修复完成后将迅速恢复常态[1～3]。活化成纤维细胞常呈梭形或星形，细胞核有凹陷或切迹，细胞质中有各种收缩细丝或张力纤维丝、丰富的粗面内质网。与静止的成纤维细胞相比，活化成纤维细胞具有更强的收缩性、增殖和迁移能力。肿瘤发生发展过程中，成纤维细胞常常被活化成为CAFs。目前认为CAFs主要来源有：①肿瘤细胞分泌多种细胞因子如TGF-β、血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等，诱导肿瘤间质及其周围的正常成纤维细胞活化成CAFs[2，3]；②肿瘤细胞通过分泌各种细胞因子募集肿瘤外的间充质干细胞，并改造成为CAFs[4]；③肿瘤细胞通过上皮间质化转变成为CAFs[2，5，6]；④内皮细胞在TGF-β等作用下通过内皮-间质转化过程转化成CAFs[5]。CAFs不但保留了成纤维细胞的特性，即表达波形蛋白，而且表达高水平的α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)，这也是CAFs的重要标志物。此外，成纤维细胞激活蛋白(Fibroblast-activation protein，FAP)、成纤维细胞特异性蛋白1(Fibroblast specific protein 1,FSP-1)、神经元胶质细胞抗原2(Neuronglial Antigen-2，NG2)、血小板源性生长因子受体β(Platelet-derived growth factor receptor-β,PDGFR-β)、成纤维细胞相关抗原以及细胞外基质中重要成分如生腱蛋白C(Tenascin-C,TN-C)和成骨细胞特异性因子2(Periostin，POSTN，或Osteoblast-specific factor 2,OSF-2)等等都可以成为CAFs的标记分子[1，7]。由于CAFs具有高度异质性，并非所有的CAFs都表达这些标记分子，同时任何一种标记分子也不可能表达在不同来源的CAFs上。CAFs来源与表型的多样性提示,CAFs在不同肿瘤及同一肿瘤的不同阶段的功能可能存在一定的特异性，并且与其所处的环境密切相关。因此，在鉴定CAFs表型时，需根据CAFs不同来源及肿瘤组织自身特点，选择合适的标志物组合。

1.2 CAFs与癌细胞的相互作用 在肿瘤演进过程中，CAFs与癌细胞之间存在复杂的相互作用。一方面癌细胞通过产生各种可溶性因子包括细胞因子、趋化因子、生长因子、代谢产物和外泌体等作用于成纤维细胞，使之活化；另一方面CAFs亦通过类似的可溶性因子作用于癌细胞，调节癌细胞的生物学行为如生长、侵袭、干性、耐药和转移等。目前已发现多种信号传导通路参与调控CAFs活化及其与癌细胞的相互作用，包括TGF-β-SMAD2/3通路、CXCL14/SDF-1/CCR4通路、IL-1β/NFκB通路、IL-6/JAK/STAT3通路等[7]。这些信号通路在间质细胞中激活后具有双向功能，一方面有利于CAFs表型的维持，另一方面通过调控CAFs产生各种细胞因子和生长因子并以旁分泌作用影响癌细胞的恶性行为。研究[8]发现，在前列腺癌和乳腺癌等恶性肿瘤演进过程中，其间质成纤维细胞p62表达下调或缺失，p62缺失通过mTORC1/c-Myc信号通路调控CAFs的氧化还原反应，进而影响CAFs的糖与氨基酸代谢过程，增加IL-6的分泌，从而促进癌细胞的生长。研究[9]结果显示，抑制Notch和下调p53活性可激活成纤维细胞，进而促进基质细胞及癌细胞的生长。新近研究[10]发现，结肠癌微环境中，在颗粒蛋白前体的作用下，TNFR2/Akt或ERK信号可促进CAFs的活化。在乳腺肿瘤中，肿瘤干细胞可分泌Hedgehog配体SHH，通过旁分泌激活Hedgehog信号调控CAFs,CAFs随后分泌一系列因子促进肿瘤干细胞的生长及自我更新[11]。目前认为，各种细胞因子介导成纤维细胞活化成CAFs是一个可逆过程，但CAFs进入非可逆活化状态需要CAFs自身的表观遗传学改变，如甲基化改变等，但详细机制未完全清楚[2]。可见，CAFs与癌细胞相互作用的动态过程中伴有癌细胞与CAFs中不同信号通路激活，并重塑了癌组织微环境。

2 CAFs对肿瘤的生长发展的影响

2.1 CAFs促进肿瘤的生长发展 相关文献[12]报道显示，CAFs能分泌多种生长因子和细胞因子如CXCL12、CCL7、TGF-β、HGF、POSTN和TN-C等，并通过旁分泌作用于癌细胞，促进癌细胞的增殖、迁移等，同时影响肿瘤化疗敏感性；CAFs可以通过上调MMPs的表达和分泌细胞外基质(ECM)蛋白重塑肿瘤基质，进而促进肿瘤侵袭转移；CAFs可以通过分泌VEGFs、FGFs和IL-6促进肿瘤血管的生成；CAFs可以通过分泌IL-1、IL-6、TNF-α、TGF-β、SDF-1和MCP-1促进肿瘤免疫抑制微环境形成，增强免疫逃逸，有利于肿瘤生长。研究[13]发现，FAP过表达的CAFs能够激活STAT3信号并募集骨髓源性抑制细胞(MDSCs),有助于肝癌的免疫抑制。新近研究[14]发现，CAFs能表达大量FAS配体，诱导表达FAS的CD8+T细胞凋亡；CAFs也可表达程序性细胞死亡1配体2(PD-L2)，通过与免疫检查点分子PD-1相互作用诱导T细胞凋亡，促进肿瘤免疫逃逸。在早期肿瘤病变的研究[15]中发现，免疫细胞可产生IL-1β，激活成纤维细胞中NF-κB信号通路，增强CAFs促炎和促肿瘤生长功能。CAFs还可以通过直接的细胞接触作用促进肿瘤细胞的侵袭[16]。间充质干细胞来源的CAFs能通过产生IL-6、Wnt-5α和骨形态蛋白4等促进肿瘤生长[17]；而CAFs中热休克因子1(HSF1)的上调表达促进癌间质重塑和肿瘤生长[18]。新近研究[19]发现，乳腺癌细胞中癌基因MYC过度激活促进含有miR-105的外泌体分泌，这些外泌体被周围CAFs摄取时，外泌体中miR-105释放并激活CAFs中MYC蛋白表达，改变CAFs代谢进程，CAFs通过释放关键代谢产物促进癌细胞生长。此外，高转移潜能肝癌细胞能够通过分泌外泌体miR-1247-3p直接靶向B4GALT3，通过激活IL-1β/NF-κB通路激活成纤维细胞，活化成纤维细胞分泌一系列促炎因子来进一步促进癌症的发展[20]。可见，CAFs主要通过产生各种细胞因子来改变癌细胞自身的生物学行为，同时塑造了肿瘤免疫抑制微环境。

2.2 CAFs抑制肿瘤的生长发展 尽管CAFs在肿瘤演进中扮演重要作用，但并非所有的CAFs都具有促癌功能。研究[21]表明，在肿瘤的进展期，TGF-β信号通路促进肿瘤的进展，但在肿瘤发生的早期阶段，CAFs分泌的TGF-β却抑制肿瘤形成。已有报道[22]证实，乳腺癌组织中表达Slit2分子的CAFs和相应正常组织成纤维细胞，在抑制表达Robo1受体的乳腺癌细胞生长上具有相似作用，主要是Robo1被激活后能直接抑制PI3K和β-Catenin信号传递，同时也阻断SDF-1/CXCR4信号通路，从而抑制癌细胞生长；相反，如果乳腺癌细胞表面缺乏Robo1受体，这些表达Slit2分子的成纤维细胞就会促进其生长。此外，在胰腺癌的相关研究[23]中发现，如果去除肿瘤中的CAFs或者抑制CAFs形成，就会加速胰腺癌的生长发展。这些结果说明，肿瘤微环境中的CAFs不仅仅具有促进肿瘤生长发展的能力，在特定条件下还能抑制肿瘤的生长发展。

3 靶向CAFs制剂在肿瘤治疗中的应用

传统肿瘤治疗方法包括化疗、放疗，主要针对癌细胞自身，尤其是生长活跃的癌细胞。然而，这些治疗手段不仅疗效差异巨大，而且肿瘤耐药、复发与转移仍是临床上面临的巨大挑战，提示肿瘤进化及异质性背后机制的复杂性。肿瘤微环境是影响肿瘤进化及其异质性的关键因素，靶向肿瘤微环境或许可以为肿瘤的治疗提供新策略。已发现成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化过程中依赖于NAD(P)氧化酶4(NOX4),靶向CAFs的药物NOX4抑制剂可以抑制CAFs促癌生长的能力，提示临床联合使用NOX4抑制剂治疗癌症可能有助于改善疗效[24]。在肝癌细胞HepG2小鼠移植瘤模型中，使用纳米脂质体搭载针对TN-C肽段和BCL-2抑制剂Navitoclax治疗肿瘤，其可以特异性与CAFs细胞表面TN-C结合，诱导CAFs凋亡，抑制肿瘤细胞生长[25]。在转移性乳腺癌小鼠模型中，使用抗毒素αFAP-PE38靶向FAP阳性的CAFs能抑制肿瘤生长，而且αFAP-PE38和紫杉醇联合应用效果更为显著[26]。研究[27]发现，小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中敲除β-arrestin可明显抑制该细胞迁移，提示β-arrestin参与维持细胞运动性和调节细胞形状，靶向β-arrestin1-cofilin信号可抑制成纤维细胞活化为CAFs，从而抑制癌细胞的侵袭与转移。这些结果提示，靶向肿瘤微环境中CAFs代谢过程或标记分子，可能会改善肿瘤治疗效果。

然而，CAFs是高度异质性的细胞群体，不同肿瘤来源的CAFs或同一类型肿瘤的不同亚型的CAFs，其分子表达谱、功能状态差异巨大。研究[28]显示，三阴性乳腺癌(TNBC)中主要富集了具有肌纤维母细胞表型且过表达CD29、FAP、α-SMA、PDGFR-β、FSP-1和CAV-1等分子标记的CAFs，同时这些CAFs通过多种机制促进调节性T细胞分化，形成免疫抑制微环境。研究[29]发现，CD10+GPR77+CAFs主要通过提供癌干细胞生存微环境促进肿瘤生长和化疗耐药，靶向CD10+GPR77+CAFs能有效抑制肿瘤生长并逆转耐药。此外，在乳腺癌中，雌激素(ER)及其类似物可以通过CAFs表面G蛋白偶联雌激素受体(GPER/GPR30)激活下游相应信号通路如MAPK通路，调控CAFs功能，介导肿瘤间质与肿瘤细胞之间相互作用[3]。研究[30]结果表明，前列腺癌CAFs过表达GPER/GPR30并抑制ER-α表达，从而激活成纤维细胞。因此，靶向CAFs表面分子或受体进而改变其内在相关信号通路(如MAPK、NF-κB通路)将可能为乳腺癌等肿瘤的治疗提供新策略。

不同肿瘤的CAFs其内在激活机制存在很大差异，靶向CAFs策略亦有所不同。动物研究[11]结果显示，溴区结构域和外周结构域(bromodomain and extraterminal domain，BET)蛋白的抑制剂JQ1能明显抑制胰腺癌组织纤维化进程，并抑制患者来源的异种移植肿瘤的生长；进一步研究发现，JQ1并非直接抑制胰腺癌细胞生长，而是通过抑制Hedgehog通路和TGF-β通路，阻止胰腺组织中星形细胞活化成为CAFs，减少CAFs中α-SMA细胞外基质、细胞因子和生长因子的表达。事实上，Hedgehog信号通路抑制剂维莫德吉(vismodegib)能明显减缓CAFs与CSCs的扩增，整体上延缓肿瘤生长。此外，JQ1处理后的CAFs条件培养基能明显抑制胰腺癌细胞中ERK、AKT和STAT3信号通路的活化，从而抑制肿瘤生长。研究[31]发现，JQ1联合吉西他滨治疗胰腺导管腺癌取得显著疗效，说明BET是参与成纤维细胞活化的重要分子，其相应抑制剂JQ1能有效抑制CAFs和癌细胞中多条信号通路，最终抑制肿瘤生长。新近研究[32]发现，与核受体结合的一些配体具有调节CAFs细胞因子表达谱功能，如维生素D受体(VDR)在胰腺癌来源的CAFs中高表达，参与调控胰腺癌中星形细胞活化，而维生素D3活性代谢物的类似物卡泊三醇能有效抑制CAFs活化，增强吉西他滨疗效。研究[31,33]发现，维甲酸能显著抑制CAFs产生IL-6和ECM，有效改善免疫抑制微环境和免疫检查点的治疗(如抗CTLA4、抗PD1/PD-L1抗体)疗效。可见，靶向CAFs内在重编程信号通路或表观遗传机制将有望更好地改善肿瘤炎症反应、逆转CAFs表型和间质重塑功能。

综上所述，CAFs作为肿瘤微环境中最主要的成分，对肿瘤生长发展起重要作用。尽管目前在一定程度上明确CAFs不仅能促进肿瘤的生长发展，亦参与抑制肿瘤生长，靶向CAFs制剂治疗肿瘤也显示出令人振奋的结果。然而，由于肿瘤进化及异质性机制复杂，与癌细胞共进化的CAFs表型与功能亦存在明显异质性，加上缺乏特异性分子标记物，以CAFs表型结合肿瘤细胞分子谱改变为依据的临床肿瘤诊疗模型尚待建立，CAFs与癌细胞共进化机制仍需进一步探讨。相信随着新技术发展如多组学研究平台、单细胞测序技术和多荧光原位检测技术等成熟，肿瘤细胞与微环境共进化的时空变化及其机制将进一步得到阐明。